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多重PCR检测沙门氏菌、大肠杆菌对磺胺类、氯霉素类药物耐药基因的研究

羊云飞  
【摘要】:本研究测定了从规模化猪、鸡场分离的33株沙门氏菌和103株致病性大肠杆菌对磺胺类药物(磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑)及氯霉素类抗生素(氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)的最低抑菌浓度(MIC),参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)(1999)的标准,判定其耐药性。结果表明,33株沙门氏菌对磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素抗菌剂的耐药率分别为57.6%、48.5%、66.7%,63.6%,33.3%;103株大肠杆菌的耐药率分别为54.39%、51.45%、54.3%,51.5%,14.6%。 本研究根据国内外在GenBank中注册的大肠杆菌、沙门氏菌对磺胺药的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3及对氯霉素类药的主要耐药基因Gat1、GmlA、Flor进行比对分析,设计出检测磺胺药耐药基因的二重PCR的两对引物(Sul1、Sul2的简并引物和Sul3的引物),以及检测氯霉素药耐药基因的三重PCR的三对引物(Cat1、CmlA和Flor引物)。通过试验条件的筛选和优化,建立了检测猪、鸡源沙门氏菌和大肠杆菌耐磺胺类药物基因的二重PCR方法和氯霉素类抗生素耐药基因的三重PCR方法。通过对33株沙门氏菌和103株大肠杆菌的磺胺药耐药基因及氯霉素类耐药基因进行检测,结果表明,这两套多重PCR技术与常规PCR技术的符合率达98.5%以上;与药敏试验的符合率达73.3%~100%,具有很高特异性。 通过灵敏性试验,该多重PCR技术能检测的细菌最低浓度为10~6CFU/ml。整个试验过程的时间只用7个小时,检测速度比常规PCR有很大提高。这两套多重PCR可用于沙门氏菌、大肠杆菌对磺胺类、氯霉素类药物耐药性的快速检测及耐药性的分子流行病学监测,具有重要的学术意义和应用价值。 本研究对沙门氏菌重庆分离株CQCS0304-2株的Sul1、Cat1基因PCR产物、大肠杆菌双流分离株SLPE 1-1株Sul3基因PCR产物、沙门氏菌双流分离株PJPS 6株的CmlA基因PCR产物和沙门氏菌重庆分离株CQCS0304-4株的Flor基因PCR产物进行了序列测定,将测序结果分别与GenBank中相应序列进行比对分析,基因序列同源率达98.4%以上,并将测序的序列在GenBank中注册,序列号分别为:AY617069、AY617066、AY617070、AY617067和AY617068。


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