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鸡传染性支气管炎病毒分离株IBV_(WHNJ)M基因DNA疫苗研究

杨帆  
【摘要】:本研究采用本课题组分离鉴定的鸡传染性支气管炎肾型毒株IBV_(WHNJ),根据Genbank中已经注册的IBV M基因序列设计一对引物,通过RT-PCR方法扩增出IBV_(WHNJ)的M基因。对M基因克隆测序结果表明,IBV_(WHNJ) M基因的编码序列全长678bp,编码225个氨基酸,与国内外发表的9个毒株M基因核苷酸序列相比较的同源性为91.6%~100%,相应氨基酸同源性为91.6%~100%。将鸡传染性支气管炎病毒分离株IBV_(WHNJ) M基因在Genbank中注册,注册号为AY302742。 将已经克隆的IBV_(WHNJ) M基因亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1上,得到重组质粒,用酶切、菌落PCR鉴定,结果表明,M基因正确插入pcDNA3.1中,成功制备了重组质粒pc-M。采用类脂薄膜水化法制备了阳离子脂质体,按10:1的比例用脂质体包被重组质粒pc-M,并通过透射电镜观察,结果表明,阳离子脂质体大小为30-200nm,包被后的复合物大小为50-400nm,形状不规则。本研究制成了IBV_(WHNJ)基因pc-M重组质粒DNA疫苗、脂质体包被的IBV_(WHNJ) M基因pc-M重组质粒DNA疫苗各一种。 对脂质体包被的重组质粒pc-M组、重组质粒pc-M组和空白对照组,进行了重组质粒DNA疫苗的免疫原性研究。试验组的免疫剂量为1ml(含200ugDNA)/羽,四点腿部肌肉注射,10日龄首免,17日龄相同剂量二免,对照组不作任何处理。免疫前、24日龄、31日龄颈静脉采血,用全自动生化分析仪和BC-2000血细胞分析仪检测外周血液中免疫球蛋白和白细胞的含量,用SPSS软件对三组结果进行统计学计算,分析结果表明:IBV_(WHNJ)基因DNA疫苗免疫后,外周血液中IgG、IgA、IgM含量显著升高,白细胞数量、淋巴细胞含量也显著提高,脂质体包被后免疫水平上升高于未包被组,而对照组无明显变化,统计结果表明,试验组与对照组相比差异显著。35日龄时以0.2ml(10~2EID_(50))剂量的IBV_(WHNJ)株对各组攻毒,统计攻毒后的发病、死亡、保护情况。结果显示,攻毒后试验组没发病,对照组第四天发病,出现了呼吸道症状并有3只死亡,结果表明IBV M基因的DNA疫苗能诱导鸡体产生免疫应答,并对强毒感染有抵抗力。 本研究采用IBV_(WHNJ)基因构建的DNA疫苗对鸡进行免疫,并对其免疫效果进行评价,在国内外还未见报道。本研究为研制IBV DNA疫苗提供了科学依据。


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