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携带IBV基因重组质粒的大肠杆菌发酵及提取工艺研究

汪洋  
【摘要】:本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒真核表达质粒(pcDNA-S1、pcDNA—M、pcDNA—N)的重组大肠杆菌为研究对象,对其发酵工艺进行了研究。 采用单因子分析和正交设计,对重组大肠杆菌的摇瓶发酵工艺进行了研究,优化了装液量、培养温度、初始pH等培养条件,摇瓶发酵后,以碱裂解法提取质粒产量可达46.5mg/L,是未优化前质粒产量的6.8倍。 研究了携带禽传染性支气管炎病毒真核表达质粒基因工程菌在20L发酵罐中的发酵工艺。进行了分批发酵和补料发酵。结果表明,补料发酵在菌体量和质粒产量上均有增加。通过补料发酵,每小时补加80ml补料培养基,菌体密度(OD600)可达到43,以碱裂解法提取质粒产量达到76mg/L。所得质粒产量是分批发酵产量的1.6倍。与LB培养基相比,菌体浓度和质粒产量分别提高了40倍和27倍。 对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提,再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化,并对纯化条件进行了优化,建立了以碱裂解法粗提,硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质,提取的质粒DNA纯度可达到1.88,超螺旋比例达到98.4%,符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。完成整个操作只需90分钟,比PEG法纯化节省了5个小时。对发酵罐发酵的菌体以本工艺提纯,质粒产量可达到100mg/L。与离子交换法比较,生产成本降低了50%。 本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本,为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。


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