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植酸酶基因(phyA)转化玉米的研究

沈亚欧  
【摘要】:植酸酶是催化植酸磷(肌醇六磷酸及其盐类)分解成肌醇和无机磷酸盐的一类磷酸酶,它可以分为两类:肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(EC.3.1.3.8)和肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(EC.3.1.3.26),其主要来源于酵母菌、霉菌及细菌等微生物;另外,在反刍动物的瘤胃和高等植物体内也含有植酸酶。磷是生物机体内不可缺少的元素,植物体内磷的主要存在形式是植酸磷,在种子中植酸磷的含量约占其总磷的70%左右。而植物体内天然植酸酶的量相对于植酸磷的水平是很低的,并不足以使植物从大量的植酸磷中释放出足量的无机磷。由于单胃动物的胃肠道也不能分泌植酸酶,从而难以充分利用植物性饲料中的植酸磷源,为满足动物对磷的需求,通常须要在饲料中添加无机磷,这样一方面提高了饲料的成本,另一方面使自然界中的无机磷资源受到严重的威胁;同时,动物不能利用的植酸磷直接从粪便中排出,又会造成环境的磷污染;此外,植酸是一种抗营养因子,它能抑制动物对植物性饲料中的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)、K~+等金属离子、蛋白质、维生素以及脂肪酸等营养成分的消化吸收,从而降低饲料的营养价值。因此,在动物饲料中添加外源植酸酶逐渐成为提高饲料营养价值和降低环境磷污染的一种有效措施。 作为一种饲料作物,玉米虽然不能为动物的生长发育提供主要磷源,但它是动物饲料中最主要的成分。通过植物基因工程手段使植酸酶在玉米子粒中高效表达,既能降低其内部植酸的水平;同时子粒在饲喂动物后,其中大量的植酸酶在动物胃肠道释放后,又能作用于胃肠道内其它饲料成分中的植酸,提高其营养价值。这样既免去了外源植酸酶的添加,降低了饲料成本,又减少了畜牧生产对环境造成的磷污染。 本研究通过基因枪和农杆菌介导两种方法将含有来源于黑曲霉N25的植酸酶phyA基因的植物胚乳特异表达载体pCBA-Hyg导入玉米优良自交系18-599(红)中,对T_0代转基因植株进行PCR检测,共获得9株PCR为阳性的植株,在这9株中有7株收获了T_0代转基因种子。对这些转基因干种子进行的植酸酶比活力测定,其中有5个株系的干种子其内部植酸酶比活力与对照相比有显著提高,最高的两个株系分别提高了60.85%和44.98%,证明phyA基因已经整合到玉米基因组染色体上并进行了有效的表达。进一步对部分转基因干种子中的无机磷含量进行测定,结果表明有两个株系的干种子中无机磷的含量与对照相比有显著提高,而它们恰好是干种子中植酸酶活力最高的两个株系,证明转基因植酸酶对种子中的植酸磷进行了有效的分解,从而提高


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