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生殖细胞特异蛋白GGN1/GGN3与二噁英诱导表达蛋白GGNBP2的相互作用

张进  
【摘要】:FANCL(也被称作PHF9、POG)是一种新近被发现,具有PHD结构域的E3泛素连接酶(ubiquitin E3 ligase)。现有的研究表明它至少在两项生理过程中发挥作用,一个是与生殖细胞的发生有关,它在胚胎期原初生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)增殖过程和成年期睾丸的生精过程(spermatogenisis)中发挥重要的作用,在小鼠中,这个基因突变的纯合体会表现出生殖细胞缺陷症(gcd)的性状;另一个则与人的范康尼氏贫血症(Fanconi animia)的发病有关,它作为一个催化亚基与范康尼氏贫血症核心复合物(Fanconi animia core complex)一起使得FANCD2单素化,单泛素化后的FANCD2将与BCRCA1、BCRCA2形成复合物参与DNA的修复过程[1][6]。在寻找与FANCL相互作用的蛋白时,筛选出了两种新蛋白编码基因Ggn1和Ggn3,它们是由生殖系统特异表达基因Ggn转录的mRNA前体通过不同的剪接方式形成的,两种蛋白均可以与FANCL相互作用[4]。在进一步寻找Ggn基因的功能时,同样使用了酵母双杂交技术寻找与GGN1相互作用的蛋白,最终我们获得三个与其相互作用的蛋白,其中之一为GGNBP2(又被称作DIF-3和ZFP403),是一种功能未知蛋白,它在成年小鼠睾丸中表达并且可在胚胎干细胞中被TCDD(2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英)诱导表达。 本实验工作主要集中于GGN1与GGNBP2相互的作用进一步确认以及功能未知蛋白GGNBP2部分性质的研究,主要内容及结果如下: 1.由于实验的需要,我们还原核表达了GGN1和GGNBP2的蛋白片段,作为抗原免疫家兔制备了GGN1和GGNBP2的抗血清,同时制备和使用了特异的抗原亲合柱对他们进行了纯化,利用组织干粉吸附法进一步提高其特异性。 2.由于当前还没有建立一种可以体外培养的生殖细胞系,所以为了以后研究的方便,又筛选建立了可以稳定表达EGFP/GGN1融合蛋白的CHO细胞株。 3.对GGNBP2的表达性质(包括亚细胞定位、组织分布、表达时相、mRNA剪接方式以及蛋白分子量大小)进行了研究。 4.通过酵母共转化、细胞共定位、免疫共沉淀等技术,逐步确定了GGN1与GGNBP2在酵母、体外培养细胞HEK293以及睾丸组织内的相互作用。 通过以上实验,我们相信将提高我们对生殖细胞发育相关的多个基因及FANC L在生殖系统中作用的认识。


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