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漆酶高产菌株的诱变选育及其酶的分离纯化、性质和基因克隆研究

黄乾明  
【摘要】:漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,广泛分布于真菌特别是白腐菌中,在高等植物、细菌、昆虫体内也有不同程度的存在。漆酶可与多酚类和芳香二胺类等多种底物作用,在木质素降解、制浆造纸生物漂白、环境保护、生物传感器制作、有机合成、食品及饮料加工等领域具有广阔的应用前景和潜在应用价值。本文以木质素降解白腐真菌粗毛拴菌(Trametes gallica)为出发菌,采用紫外诱变选育漆酶高产菌株,并对菌株产酶条件、酶的分离纯化、酶学性质和基因克隆进行了系统研究。取得如下主要研究结果: 1.以粗毛栓菌T.gallica为出发菌株,通过紫外诱变处理其担孢子、PDA-RB亮蓝平板变色法初筛、ABTS法测定培养液漆酶活力复筛,获得1株漆酶高产诱变菌株SAH-12。用高氮低碳高无机盐培养液(LM3)培养时,其峰值酶活力比出发菌株高出4倍,达到5002.6U/L,且产酶稳定。对SAH-12液体培养产酶条件研究表明:以纤维二糖和蔗糖为碳源明显优于麦麸、淀粉和葡萄糖,其最高酶活分别达18526U/L和13436U/L;有机氮源较无机氮源更有利于SAH-12漆酶的分泌,以蛋白胨、大豆粕和胰化蛋白胨为氮源时其峰值酶活分别达到20544U/L、19671U/L和16180U/L;适宜初始培养pH为4.0;ABTS、单宁酸、没食子酸对产酶均有明显的诱导作用,其中ABTS和单宁酸的诱导效果相对更好,愈创木酚和吐温-80对产酶有一定的抑制作用;SAH-12在优化的培养液中,漆酶最高活性产量可达26373.5U/L。 2.应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)活性染色和RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA)技术,对T.gallica及其紫外诱变选育菌株SAH-12进行了漆酶同工酶谱和基因组DNA的RAPD比较分析。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳活性


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