胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究

【摘要】：基因芯片技术能在单一检测中从种、亚种、型和亚型水平上同时鉴定多种病原，为多病原联合检测和病原分型提供了一项新技术。基因芯片技术具有敏感性高，特异性强、高通量和平行性的优点。本研究对胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的检测和分型靶基因进行了设计，以PCR方法扩增出用于三种细菌联合检测和胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因，并建立了检测三种细菌和胸膜肺炎放线杆菌基因分型的基因芯片。建立的APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片是一种新的检测技术，将对监测、联合诊断和防治这三种猪呼吸道细菌病发挥重要作用。 根据胸膜肺炎放线杆菌的16S rDNA、apxⅣA、dsbE、omlA、apx和荚膜多糖(cp)基因，猪肺炎支原体的16S rDNA和P36蛋白基因，多杀性巴氏杆菌的psl和KMT1基因，入噬菌体DNA共设计和选用了23对引物，除选用引物外，其它引物由Arraydesigner 2.0软件设计。用23对引物共扩增出25个不同靶基因，并克隆到pMD18-T载体中。其中7个检测靶基因：胸膜肺炎放线杆菌3个(apxⅣ、dsbE、A16S)，猪肿炎支原体2个(M16S、P36)，多杀性巴氏杆菌2个(psl、KMT1)；17个用于胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因：omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx3、cpx6、cpx9、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD；一个定位靶基因λDNA。对克隆的25个靶基因质粒进行了序列测定和序列比对。结果发现，靶基因A16S与放线杆菌属内所有放线杆菌的16SrRNA的同源性均在95％以上，靶基因M16S与猪肺炎支原体、絮状支原体和猪鼻支原体的16SrRNA的同源性分别为100％、95％和88％；靶基因apxⅣ、dsbE、P36、KMT1和psl与各自不同型或株的相同基因序列的同源性均在92％以上。除分型靶基因apxⅠD和apxⅢD序列间的同源性在75％外，其它分型靶基因序列间的同源性均在67％以下。 用7个检测靶基因制备APP-Mhp-PM检测基因芯片，选用omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx6、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD 15个分型靶基因制备APP分型基因芯片。靶基因A16S、dsbE和apxⅣ联合检测胸膜肺炎放线杆菌；靶基因M16S和36联合检测猪肺炎支原体；靶基因psl和KMT1联合检测多杀性巴氏杆菌。15个分型靶基因的不同组合用于胸膜肺炎放线杆菌的基因分型。用基因芯片点样仪SpotArray 24将异丙醇沉淀法制备的浓度在250～300 ng／μl的