收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究

周生  
【摘要】: 禽传染性支气管炎(IB)呈世界广泛流行,是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(IBV)很容易发生变异,导致新的变异株不断出现,且不同毒株之间交叉保护力弱,使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发,造成了严重的经济损失。在前期工作基础上,本研究对IBV肾型分离株SAIBk株的全基因组和11株分离株的3′端非编码区进行了序列测定和分析,并进一步构建了SAIBk株S1、M、N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行表达研究,在此基础上构建了S1、M、N基因的真核表达质粒并对其免疫原性进行了比较研究,为从分子水平研究IBV的流行进化及研制预防和控制IB的DNA疫苗奠定基础。 1.选择具有一定代表性的IBV致肾病变型分离株SAIBk株,采用RT-PCR方法将其基因组分19个片段进行了扩增、测序及分析。结果表明:SAIBk株能引起鸡胚矮化,形成侏儒胚;其病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后,在电镜下可观察到典型的冠状病毒粒子;SAIBk株基因组全长27520bp,核苷酸组成中A+T的含量占61.74%;具有典型的冠状病毒基因组结构,其528-20410位为RNA依赖的RNA聚合酶基因,编码两个多聚蛋白ORF1a和ORF1b,20361-27155位主要编码病毒的各种结构蛋白,包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白;SAIBk株与Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因组序列的同源率介于85.6%-87.6%之间;不同区域的同源性比较结果表明,3′UTR和5′UTR是基因组中最为保守的区域,同源率介于90%-98%之间,而S1基因是基因组中变异最大的区域,同源率介于74.8%-83.2%之间。本试验在国内外首次对IBV肾型分离株的基因组全序列进行了测定,丰富了冠状病毒的生物信息数据库,为进一步研究该病的分子流行病学和DNA疫苗奠定了基础。 2.选择11株IBV分离株,采用RT-PCR方法对其3′端非编码区进行了测序及分析。结果表明:11株分离株3′端非编码区的PCR扩增片断长度介于328bp—512bp之间;将11株分离株与Genbank上登录的15个毒株的序列进行比较分析,表明3′非编码区存在大量的碱基插入和缺失,不同毒株之间碱基数目最大相差208bp;根据不同毒株在3′非编码区片段的大小,可以将26个毒株分成4组;26株毒株3′非编码区的进化树分析结果与按照3′非编码区片段大小进行分组有较一致的结果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均属于第二组,基因Ⅲ型毒株属于第三组,基因Ⅳ型毒株属于第四组,而第一组的毒株均为国外分离毒株。本试验通过测定11株IBV分离株3′端非编码区的序列,为IBV分离株的分子流行病学研究提供科学依据。 3.构建S1、M和N基因的荧光融合表达质粒,转染Vero细胞后观察结构蛋白在细胞内的表达与分布。结果表明:酶切分析和测序结果证明构建了融合表达质粒pS1-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed;在S1、M、N结构蛋白上均未分析出有核定位信号;转染了pS1-EGFP、pS1-DsRed质粒的Vero细胞,细胞的胞浆和胞核区均显示出绿色荧光或红色荧光,荧光的强度随着转染时间的增加而增强;pM-EGFP、pM-DsRed质粒转染的Vero细胞,激发的绿色和红色荧光仅分布在胞浆区域,且分布不均匀,表明pM-EGFP、pM-DsRed质粒表达的M-EGFP和M-DsRed在胞浆中发生了聚集;pN-EGFP、pN-DsRed质粒表达的融合蛋白在胞浆区域或胞核区域发生了部分聚集。本试验首次构建了S1、M和N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行了表达研究,为进一步研制的IBV DNA疫苗提供了理论基础。 4.选择高效的真核表达载体pcDNA3.1(+),将分离株SAIBk株的S1、M、N基因分别插入其多克隆位点,构建真核表达质粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN,对构建的表达质粒进行酶切和测序鉴定,用脂质体转染Vero细胞,进行蛋白的表达和鉴定。结果表明:酶切和DNA测序证实重组质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN构建正确;通过RT-PCR、间接免疫荧光检测证实IBV的S1、M、N基因能在细胞中正确的转录和表达。本试验构建了S1、M和N基因的真核表达质粒,并在细胞中进行了表达检测,为进一步的DNA疫苗免疫试验提供了材料。 5.将构建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒单独或按比例混合进行动物免疫试验。结果表明:雏鸡免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒后,均能产生特异性抗体,对强毒的攻击具有一定的保护力,其中pIBVM的保护率为37.5%;将pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒混合免疫所产生的抗体水平和对强毒攻击的保护力,均要优于单基因的效果;将三基因混合的质粒以脂质体为佐剂进行免疫原性研究,在试验期间脂质体包裹DNA疫苗组与裸质粒疫苗组的抗体水平差异不显著,但前者的抗体水平一直要高于后者;脂质体包裹DNA疫苗组的外周血CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量要显著高于裸质粒疫苗组,两者差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);在攻毒保护率上,脂质体包裹DNA疫苗组的保护率为72.7%,要优于三基因混合裸质粒DNA疫苗组的54.5%。本研究首次在国内外对M基因及S1、M、N基因混合DNA疫苗的免疫原性进行了比较研究,研制出脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗,对有效的预防和控制IB的流行具有重要的意义。


知网文化
【相似文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 周生;禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究[D];四川农业大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978