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不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因关系的研究

张丽萍  
【摘要】: 本研究以实时荧光定量TagMan-PCR和原代培养猪回肠上皮细胞技术,研究了不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因的关系。研究包括六个试验。 试验一猪拟杆菌属-普雷沃氏菌属16SrDNATagMan-PCR实时荧光定量PCR方法建立 通过对猪肠道30种细菌的16SrDNA序列进行比对分析,设计拟杆菌属—普雷沃氏菌属荧光定量的特异引物;以多形拟杆菌菌株(CDC1404-A)基因组的DNA为模板,用常规PCR引物扩增16SrDNA靶片断,将PCR产物纯化后作为DNA标准品,按1.19×10~2—1.19×10~6copies/ul 5个稀释梯度的标准品作模板,建立定量标准曲线:用TaqMan探针建立25ul反应体系,对不同浓度的多形拟杆菌DNA样品进行检测,检测探针的敏感性;并以乳酸杆菌、大肠杆菌和双歧杆菌的基因组DNA模板作阴性对照,检测拟杆菌属—普雷沃氏菌属的特异性。结果表明: 1)通过克隆测序,得到了拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌的16SrDNA部分共有片段序列,该序列与Genbank中发表的多形拟杆菌(基因序列号为M58763)和中间普雷沃菌(基因序列号为AY323522)16SrDNA基因序列相比,该片段为多形拟杆菌的792~1003和中间普雷沃菌的763—974位碱基的片段,同源性分别为92%和94%。 2)25ul PCR反应体系中Mg~(2+)的最佳工作浓度均为5.0mM,探针最佳工作浓度为0.2μm,Taqman探针敏感性为3.73个/ul; 3)本试验所制作的标准品稀释度在1.19×10~2—1.19×10~6copies/ul范围线性关系良好,标准品可用于后续试验的研究。 试验二不同品种猪肠道微生物与体脂的关系 试验通过选用在同一条件下饲养的0、1、2、3、4和5月龄的长白和太湖猪各4头,屠宰取后回肠和盲肠内容物,检测1、3和5月龄长白和太湖猪回肠和盲肠内容物的总细菌、革蓝氏阳性细菌(Gram positive bacteria,G~+)、革蓝氏阴性细菌(Gram negativebacteria,G~-)、革蓝氏阳性细菌/革蓝氏阴性细菌(G~+/G~-)、拟杆菌属-普雷沃氏菌属(Bacteroides-Prevotella, B. P)细菌数量、背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪。结果表明: 1)太湖猪的回肠和盲肠内容物的G~-及B.P细菌数量在不同年龄阶段均显著(p<0.05)高于长白猪,G~+/G~-极显著低于(p<0.01)长白猪,总细菌、G~+与长白猪无显著差异(p>0.05)。 2)猪回肠和盲肠的B.P和G~-数量都与背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪都有正相关关系,而G~+/G~-比例与背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪有负相关关系。 试验三猪ANGPTL4基因的克隆及其实时荧光定量TaqMan-PCR检测方法的建立 为了对ANGPTL4基因进行更为准确定量,本研究首先克隆长白和太湖猪的ANGPTL4和β-actin的DNA序列。根据所测定的序列,分别设计引物和探针,以回肠基因组的cDNA为模板,用常规PCR引物扩增,将PCR产物纯化作为DNA标准品,ANGPTL4和β-actin基因标准品分别按1.37×10~4-1.37×10~9和8.31×10~5-8.31×10~(10)copies/mL的稀释梯度建立定量标准曲线,以TaqMan探针建立25ul反应体系,优化探针的最佳工作浓度,并检测探针的灵敏度。结果表明: 1)应用克隆测序方法获得了长白和太湖猪的目的基因ANGPTL4和内参基因;β-actin的部分序列,所获得的长白和太湖猪的ANGPTL4的片断与参照序列(AY751522)的同源性分别为98%和92%,而B-actin与参照序列(U07786)的同源性都为98%。 2)ANGPTL4和β-actin探针在25ul体系中的最佳工作浓度分别为0.35μM和0.40μM,探针的灵敏度分别为13.7和83.1拷贝/ul; 3)所构建的ANGPTL4和β-actin的标准曲线良好,反应体系中分别含有1.37×10~4-1.37×10~9和8.31×10~5-8.31×10~(10)copies/mL时,扩增反应ct值与拷贝数的对数呈线性关系,所得标准品可以用于后续试验。 试验四ANGPTL4基因在猪不同组织器官中的表达差异 试验通过选用在同一条件下饲养的4月龄长白和太湖猪各4头,屠宰后取肝脏、脂肪、心脏、空肠、回肠、盲肠和结肠。根据试验三克隆的长白和太湖猪的ANGPTL4基因的序列,采用半定量RT-PCR技术检测ANGPTL4在不同品种组织中的表达差异。结果表明: 1)猪ANGPTL4基因在肝脏、脂肪、心脏、小肠和大肠四种组织中都有表达,其中在脂肪组织的表达最丰富,其次是肝脏、大肠、心脏、小肠。 2)太湖猪的脂肪和肝脏组织ANGPTL4基因相对表达量都极显著(p<0.01)高于长白猪,回肠和空肠中ANGPTL4基因表达量极显著低于(p<0.01)长白猪,盲肠、结肠、心脏中ANGPTL4基因表达量与长白猪无差异(p>0.05)。 试验五不同品种猪回肠微生物与ANGPTL4基因的关系 选择0日龄健康正常的太湖猪和长白猪各24头进行150天的试验。每个品种设为一个处理,每个处理按体重一致原则设4个重复,公母各半,每个重复6头猪。在同一环境条件下饲予相同的饲粮,分别在0、1、2、3、4、5月龄,每种猪各屠宰4头,测定回肠中ANGPTL4基因表达量和拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌数量。结果表明: 1)1-5月龄的太湖猪回肠拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量均高于长白猪,特别是在2、3和5月龄,极显著(p<0.01)高于长白猪。两品种猪的拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量,都是随着年龄增加,呈现先增加,2月龄下降,然后再上升的规律。 2)1-5月龄太湖猪回肠ANGPTL4基因表达量均低于长白猪,特别是在1、2和5月龄极显著(p<0.01)低于长白猪,但在0日龄与长白猪的差异不显著(p>0.05);两品种猪ANGPTL4基因表达量与拟杆菌属-普雷沃氏菌属的变化成相反趋势,即先下降,后增加,再下降。 3)猪回肠拟杆菌、G~-数量都与回肠ANGPTL4基因表达存在显著(p<0.01)的负相关关系,而G~+/G~-比例与回肠ANGPTL4基因表达存在极显著(p<0.01)的正相关关系。 试验六多形拟杆菌及代谢产物对猪回肠上皮细胞ANGPTL4表达的影响 本试验以原代培养猪回肠上皮细胞为研究模型,研究了多形拟杆菌及其代谢产物对猪回肠上皮细胞ANGPTL4表达的影响。试验设7个处理,多形拟杆菌-1(108Cfu/ml),多形拟杆菌-2(10~7Cfu/ml)、多形拟杆菌-3(10~6Cfu/ml)、代谢产物-1(10~8稀释度)、代谢产物-2(10~7稀释度)、代谢产物-3(10~6稀释度)及对照组。10~8Cfu/ml多形拟杆菌和其相应代谢产物组都设20个重复,其它处理组设4个重复,每个重复1孔,在37℃培养96h后分别换为含多形拟杆菌10~8、10~7、0~6Cfu/mlDMEM培养液和相应的代谢产物,分别于1、3、7、12和26小时收集10~8Cfu/m多形拟杆菌和其相应代谢产物处理组的细胞,观察随浓度和作用细胞时间的变化,多形拟杆菌和其代谢产物影响ANGPTL4基因的表达情况。试验结果表明: 1)多形拟杆菌与肠细胞数目为1:1时。即可抑制回肠ANGPTL4基因表达,这种抑制作用随多形拟杆菌的浓度增加和作用时间延长越明显。 2)多形拟杆菌产生的代谢产物不影响ANGPTL4基因表达,但随着时间的延长,ANGPTL4基因表达有提高的趋势(p>0.05)。 综合上面六个试验,可得出如下结论: 1)太湖猪回肠和盲肠内容物G~-及B.P的数量高于长白猪,而G~+/G~-低于长白猪,总细菌数及G~+与长白猪的差异不显著;随年龄的增加,总细菌数、G~+、G~-的数量有增加的趋势,G~+/G~-有下降的趋势,B.P的数量呈现上升-下降-再增加的趋势; 2)太湖猪回肠ANGPTL4基因表达量低于长白猪,随年龄增加即先下降,后增加,再下降; 3)多形拟杆菌可抑制回肠上皮细胞ANGPTL4基因表达量,而其代谢产物无明显作用; 4)回肠和盲肠的拟杆菌属—普雷沃氏菌属及G~-与体脂有正相关关系,G~+/G~-与体脂有负相关关系。


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