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蜜柚苦味物的HPLC检测、提取及脱苦菌株的筛选

胡阳  
【摘要】: 本研究的主要目的是获得产脱除蜜柚中三种主要苦味物(柚皮苷、柠檬苦素和诺米林)的代谢酶菌株,进而获得可用于蜜柚果汁脱苦的酶制剂,为酶法脱苦生产无苦味的蜜柚果汁及其深加工产品提供前期基础。而建立苦味物质的检测方法及提取获得苦味物质是进行菌种筛选及相关研究的必要条件。本论文从苦味物质分析方法的研究入手,建立了蜜柚苦味物质的HPLC方法,在此基础上优化了蜜柚苦味物质的提取方法并以蜜柚苦味物为选择性成分筛选了苦味物质分解菌株,主要研究结果如下: (1)通过对流动相、PH值、溶剂比例及柱温等色谱条件的优化,得到琯溪蜜柚中主要的天然的苦味物(柚皮苷,柠檬苦素和诺米林)的HPLC检测条件为:色谱柱为Symmetry C18柱,流动相是甲醇∶乙腈∶磷酸缓冲液(0.01mol/L pH3.5)=9∶3∶8(V/V),流速1.0ml/min,检测波长210nm,柱温35℃. (2)柚皮苷、柠檬苦素和诺米林分别在1.80~115μg/mL,4.30~137.5μg/mL和5.82~186.25μg/mL范围内所建立的高效液相色谱检测体系有良好的线性关系,R~2值分别为0.999,0.9968和0.9993;检测限分别为0.3196μg/mL,2.295μg/mL,2.7541μg/mL;加样回收率分别为97.80%(RSD=1.86),95.32%(RSD=2.04)和98.54%(RSD=3.17);高效、准确、重复性好。 (3)琯溪蜜柚成熟果实中不同部位其苦味物的含量不同,柚皮苷的含量分布为:囊衣>白皮层>油胞层>果肉,柠檬苦素的含量分布为:囊衣>油胞层>果肉>白皮层,诺米林的含量分布为:囊衣>果肉,白皮层和油胞层的含量在检测限以下,囊衣中三种苦味物含量都是最高的,分别为976.13(μg/g原料),860.46(μg/g原料),351.83(μg/g原料)。 (4)对琯溪蜜柚成熟果实中主要苦味物(柚皮苷、柠檬苦素、诺米林)的提取的工艺进行研究,优化的工艺条件为:囊衣粉用石油醚于索氏提取器中彻底脱脂,再加入20倍(体积/质量)丙酮于40℃、pH7.0浸提15h,所得苦味物的总量可达3467.71(μg/g原料),其中柚皮苷2425.97(μg/g原料),柠檬苦素716.63(μg/g原料),诺米林325.11(μg/g原料)。 (5)脱苦酶产生菌株的筛选:以苦味物浓缩物为唯一碳源配制培养基,经富集、平板分离、初筛后获得324株菌株,用试管培养、液相色谱仪分析苦味物质含量的方法复筛出综合脱苦酶分解菌株106株,柚皮苷分解菌株128株,柠檬苦素类化合物分解酶菌株21株,其中,一株具较高综合脱苦酶活力的菌株,实验室编号4-D5,其柚苷酶活力为121μg/ml·min,柠檬苦素脱苦酶活力5.6μg/ml·min,经初步鉴定菌株4-D5属于半知菌亚门(Deuteromycotina);丝孢纲(Hyphomycetes);丛梗孢目(Moniliales);丛梗孢科(Moniliaceae);曲霉属(Aspergillus)。


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