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鸡病毒性关节炎病毒增殖特性与间接ELISA抗体检测方法的建立研究

陈元坤  
【摘要】: 本研究对鸡病毒性关节炎病毒(ARV)鸡胚增殖特性进行了探索,建立了检测该病抗体的间接ELISA方法,为开展该病的病原分离鉴定、疫病诊断和流行病学调查奠定了基础。 种毒经鸡胚增殖后收集尿囊膜毒、尿囊液毒、卵黄液毒和胚体毒,再分别接种卵黄囊,以胚体毒致死鸡胚的时间最短,尿囊膜毒致死鸡胚的时间最长;病毒经氯仿处理后接种卵黄囊,鸡胚死亡时间比未经氯仿处理的对照组推迟15h,说明病毒对氯仿具有一定的敏感性;病毒经卵黄囊、尿囊腔和尿囊膜3种途径接种鸡胚,最早死亡时间分别为51h、53h和56h。将ARV鸡胚毒分别用50%饱和(NH_4)SO4沉淀、10%PEG6000沉淀和差速离心纯化,测得蛋白含量分别为8.699mg/ml、17.684mg/ml和5.35mg/ml,其中,前2种方法杂蛋白含量相对较高。差速离心的样品,电镜下观察到了大量规则排列的病毒粒子,无囊膜,有双层衣壳,直径约为75nm。以差速离心纯化的病毒作为包被抗原,建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法,确定了抗原最佳包被浓度为252μg/ml,1%BSA封闭1.5h,血清最佳工作浓度为1:160,37℃反应1.5h,酶标兔抗鸡的稀释度为1:5000,37℃作用1h,底物37℃作用15min。特异性试验结果表明,NDV、IBDV、支原体的阳性血清OD值均小于ARV阴阳性血清的临界值,与抗原没有交叉反应;未加ARV抗原阻断的对照ARV阳性血清的OD值大于抗原阻断的阳性血清的OD值,而加ARV抗原阻断的各稀释度的阴性血清OD值较接近;人工感染鸡在接种ARV鸡胚毒7d、15d、20d和25d用间接ELISA进行抗体检测,均能检出血清抗体阳性,能检出血清的最高稀释倍数为1:640,比对照试验具有更高的敏感性。


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