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枇杷花药胚状体的发生组织学、农杆菌介导转化和EMS诱变研究

侯春霞  
【摘要】: 本试验从组织学方面研究枇杷花药胚状体的起源,探讨以枇杷花药胚状体为受体进行外源基因的转化方法,初步建立以农杆菌介导的枇杷花药胚状体为受体的外源基因转化方法,将外源基因CycD2引入了枇杷。同时以枇杷花药胚状体为材料,采用不同浓度的EMS和不同处理时间进行化学诱变,并对诱变处理后的枇杷花药胚状体进行RAPD分析,旨在获得突变体,为丰富枇杷育种新材料奠定一定的理论和技术基础。主要结果如下: 1.组织学研究证实,花药胚的发育经历球形胚,心形胚,鱼雷形胚及子叶形胚的发育历程。在心形期与鱼雷形期胚之间,胚内开始形成维管束组织;到鱼雷形期,维管束组织进一步发育,开始形成V字形维管束;当胚发育到子叶形期时,维管束组织进一步完善,形成明显的V字形维管束。 次生胚发生以间接途径进行时,次生胚发生的起源为内起源。在愈伤组织内部,胚性细胞(染色过程中着色深,具有明显的细胞核,体积较小,细胞结构紧密,细胞质浓,分裂旺盛)的细胞壁增厚,与其它细胞隔离开,形成相对独立的单细胞原胚或多细胞原胚;紧接着细胞进行分裂,形成二细胞原胚、四细胞原胚和多细胞原胚。胚性细胞在进行第一次分裂后就建立了极性,分裂形成的胚性细胞团内部结构紧密,与周围其它细胞相对隔离。 当次生胚发生以直接接途径进行时,次生胚发生的起源为外起源。即在子叶胚的中胚轴到下胚轴之间的表皮细胞开始分裂,分化形成胚性细胞,胚性细胞分化形成二细胞原胚,四细胞原胚及多细胞原胚,多细胞原胚进一步分化,在胚的中胚轴到下胚轴的表明形成凸起的球形胚,球形胚进一步发育形成心形胚,鱼雷形胚及子叶形胚。 2.安必西林适用于对转化枇杷花药胚状体的筛选。枇杷花药胚状体与农杆菌EHA52共培养后转移到选择培养基上,所选用的四种抗菌素中安必西林、噻孢霉素和硫酸庆大霉素对农杆菌的抑制效果较好,羧苄青霉素不能有效抑制农杆菌EHA52的生长。与不含抗菌素的培养基相比,抗菌素的加入均降低枇杷花药胚状体的增殖率。安必西林在所测试的几种抗菌素中不仅能很好的控制农杆菌EHA52的生长,而且对枇杷花药胚状体的生长和增殖影响最小,噻孢霉素次之。硫酸庆大霉素虽然能够很好地控制农杆菌EHA52的生长,但是由于它对枇杷花药胚状体有很强的毒害作用,导致枇杷花药胚状体褐化现象严重,生长和增殖都都受到严重影响,故不适用于对转化枇杷花药胚状体的选择。综合各种因素认为安必西林的浓度在500mg╱L~1000 mg/L适用于对转化枇杷花药胚状体的筛选。 3.CycD2基因被成功转入了枇杷花药胚状体。转化后的枇杷花药胚状体增殖,采用CycD2特异引物对次生胚DNA进行PCR扩增,电泳结果发现含有质粒CycD2的农杆菌DNA,经过遗传转化后的枇杷花药胚状体DNA在500~600bp有谱带,而没有经过转化的枇杷花药胚状体的DNA则没有相应的谱带,表明CycD2基因已经转入枇杷花药胚状体中。 4.经过EMS处理的枇杷花药胚状体生长和增殖能力下降。将枇杷花药胚状体转入到含0.1%~0.9%EMS的溶液中振荡0.5h,1h和2h。转入培养基中观察发现枇杷花药胚状体的死亡率很高,多数花药胚状体表面变黑,褐化死亡,0.3%EMS处理0.5h的存活率最高为46.8%,0.7%EMS处理2h的枇杷花药胚状体存活率最低为2.8%。经过EMS处理的枇杷花药胚状体增殖能力显著低于未经过处理的枇杷花药胚状体,分化的次生胚的生长和分化能力也变弱,同时分化的次生胚多以球形胚为主。 5.经过EMS处理的枇杷花药胚状体增殖,提取DNA,进行RAPD分析。经检测,发现一些诱变处理过的胚状体扩增的谱带与对照谱带发生了变化。从扩增图谱可以看出:以s55为引物时,有11个处理与对照扩增谱带发生了变化;以s232为引物时,11个处理与对照扩增谱带发生了变化,以s377为引物时,有13个处理与对照扩增谱带发生了变化,以s362为引物时,3个处理的谱带与对照发生了变化。在所有处理中,以0.3%EMS处理2h差异最为显著。


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