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立枯丝核菌AG1-IA诱导玉米基因差异表达分析及防卫酶活性检测

马永毅  
【摘要】: 玉米纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的真菌性病害,该病主要发生在中国和东南亚地区,表现出一定的区域性,近年来该病流行速度和蔓延趋势日渐严重,加上该病害喜温喜湿,随着全球气候变暖,在未来几年很有可能传播到其他国家和地区,成为一种世界性的流行病害。玉米是我国的主要粮食作物之一,该病害的发生已严重制约了玉米的产量和品质的提高。深入研究玉米对纹枯病的抗病机制,发掘抗病基因并对其克隆和功能分析,是加快抗病基因工程育种的有效途径。本研究利用cDNA-AFLP技术和生物信息学相结合的分析方法,通过建立相关抗病基因表达谱,从抗病基因表达的水平上探索玉米对纹枯病的系统抗病机制。 实验所用材料为本课题组多年筛选鉴定出的高耐玉米纹枯病材料R15和高感材料478,纹枯病菌为立枯丝核菌高致病性融合菌群AG1-IA。材料种植于四川农业大学濆江农场,拔节期时采用人工嵌入法将两粒布满菌丝的麦粒接入玉米叶鞘,并保温、保湿,分别取接种后16 h、24 h、36 h、48 h、60 h的玉米接菌叶片,提取叶片的总RNA进行反转录并利用cDNA-AFLP技术分析AG1-IA诱导下高耐玉米纹枯病材料R15的基因表达谱,同时对接菌后两个存在抗病差异自交系材料的不同部位不同时间段的氧化酶活性进行分析。获得的主要结果如下: 1.经56对AFLP选扩增引物筛选共观察到87个差异片段,选取效果较好60个进行回收,有35个可得到有效回收,将经过两次回收得到的差异片段连接载体转化到质粒中,并选送18个克隆由测序公司测序。 2.将18个EST序列测序结果提交到Genbank进行Blast比对,5个EST序列未找到同源序列,已知基因功能的EST序列11条,已知mRNA和基因组序列各1条。13条具同源性的EST具体比对结果如下:玉米锈病抗性蛋白基因、衰老相关蛋白、gag蛋白、SNF2因子、丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白、丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶家族蛋白、NADH脱氢酶亚基K、NADH脱氢酶亚基2、墨西哥蜀黍颖可塑因子1、多蛋白(polyprotein)、Zea mays PCO118792mRNA sequence. Zea mays subsp. parviglumis mitochondrion, complete genome。 3.通过对接菌后两个玉米不同抗性自交系间叶鞘及叶片两个部位的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定,结果显示在抗性材料R15的叶鞘中除PAL变动不大外,POD、CAT、SOD和APX活性都有不同程度的增加,其中POD活性变化最为剧烈,接菌后的R15叶片POD、CAT和APX表现上升,SOD、PAL表现下降;高感材料478的POD、CAT在叶片与叶鞘中均表现上升,SOD叶片中上升叶鞘中下降,PAL和APX均无明显变化。总体而言POD、CAT水平与材料抗性呈正相关。结果表明上述防御酶系在植物体中的不同作用区域和作用时间,相互协作共同完成植物的抗病防御反应。


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