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猪肺炎支原体膜蛋白免疫亲和层析及ELISA检测方法的建立

陈杰  
【摘要】: 猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性接触性呼吸道传染病。主要症状及表现为咳嗽、气喘、饲料的利用率低,病猪生长十分缓慢,甚至生长停滞。该病以发病率高,死亡率低为其特点。而在临床上检测感染猪,仍面临困难。猪肺炎支原体的表面膜蛋白是该菌主要的免疫抗原,对猪肺炎支原体感染的诊断有重要意义。 本研究通过制备抗猪肺炎支原体高免血清,运用辛酸-硫酸铵盐析和阴离子交换层析技术,获得高活性、高电泳纯的IgG。再将纯化IgG与CNBr-activated Sepharose4B偶联制得抗Mhp—免疫亲和层析柱,以提取和纯化通过TritonX-100结合KI破碎的支原体细胞所获得的猪肺炎支原体膜蛋白。纯化的膜蛋白抗原经SDS-PAGE电泳分析,结果显示,纯化后的抗原蛋白分子的纯度显著提高,仅呈现66KD,48KD,46KD,40KD,32KD和24KD的6条清晰的蛋白条带,而未纯化的膜蛋白条带有11条,分子量范围在20KD-100KD之间。 本研究采用纯化的膜蛋白抗原建立了猪肺炎支原体的间接ELISA检测方法。试验确定的最适ELISA工作条件为:包被纯化抗原蛋白浓度5ug/ml,血清稀释度为1:80,封闭液为1.5%BSA,封闭时间120min,抗原抗体作用时间90min,酶标二抗SPA(1:1000稀释)作用时间为60min,阴阳性界限OD值为0.289。 分别用纯化抗原和粗提抗原包被ELISA板,对比二者的检测结果发现,纯化抗原对样品的阳性检出率比粗提抗原提高了7.5%。用建立的标准猪肺炎支原体ELISA检测方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试剂盒同时检测50份血清样品,二者总的符合率为92%。对临床送检的150份不同年龄段的猪血清样品,用该ELISA方法检测,结果显示,断奶前仔猪Mhp感染率为44.2%,保育猪为41.2%,育肥猪为17.9%。检测结果说明,猪肺炎支原体在猪群中广泛存在,也证明了建立的猪肺炎支原体ELISA检测方法在临床诊断中具有重要的实用价值。


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