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猕猴溶组织内阿米巴原虫病病原分离鉴定及凝集素hgl基因的原核表达

姜波  
【摘要】: 本研究从猕猴阿米巴病例的腹泻粪样中分离到一株阿米巴原虫,该原虫经过实验室的培养和形态学观察后,初步鉴定为溶组织内阿米巴或迪斯帕内阿米巴,采用鉴别溶组织内阿米巴和迪斯帕内阿米巴的虫种特异性引物,对阿米巴原虫peroxiredoxin基因进行PCR扩增,结果显示溶组织内阿米巴特异性引物扩增出了相应大小的DNA片断,经过克隆后测序,序列分析(登录号为:EU022309)显示本虫株与人溶组织内阿米巴株序列同源性为98%—99%,而与人迪斯帕内阿米巴株序列同源性仅为89%,鉴定该阿米巴猕猴分离株为溶组织内阿米巴,命名为Entamoeba histolytica MH530株。 参照GenBank中收录的人溶组织内阿米巴原虫半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素的重链hgl基因序列设计一对引物,通过PCR扩增获得与预期相符的产物,经过克隆后测序,得到1761bp的有效基因序列。通过对该基因核苷酸序列和推导的氨基酸进行分析,结果表明核苷酸序列与人溶组织内阿米巴的序列同源性在93.44%-96.21%之间,与人迪斯帕内阿米巴的序列同源性为87.44%。该基因编码了一个有587个AA的多肽,分子量为65.514KD,等电点理论值为5.17,具有较强的亲水性,蛋白抗原性分析显示其抗原位点分布于整个蛋白质多肽链。该序列已登录在GenBank上(登录号为EU244479)。 根据获得的基因序列设计一对表达引物,对其中重要的含多个抗原决定簇的LC3段进行原核表达,制备目的基因和表达载体,将目的片断插入pET32 b(+)表达载体上,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用1.0mM/L的IPTG诱导表达了猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段,SDS—PAGE分析表明,在相对分子质量约66KD处出有明显的蛋白质表达条带,而对照组pET32 b(+)空质粒菌在此处没有条带,该蛋白在3h时基本达到表达量最大值,而IPTG浓度在0.05mM/L和2.0mM/L之间没有明显表达差异,均都得到了很好的表达。


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