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细菌氯霉素类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒研究与应用

杨鑫  
【摘要】: 本研究选择3个氯霉素类药物耐药基因(cat1、cmlA、flor)作为扩增目的基因,建立了单重PCR检测方法,应用该方法筛选出了一株同时携带cat1、cmlA、flor三种耐药基因的阳性菌株(SLPE3-1)以作为试剂盒阳性对照株。 本研究对氯霉素类药物耐药基因三重PCR反应体系条件进行了优化,结果显示,最佳反应体系为:在25μl体系中,10×PCR Buffer2.5μl,MgCl_2(25mmol/L)3μl,dNTP(2.5mmol/L)4μl,Taq DNA聚合酶0.2μl,上、下游引物(25mmol/L)cat1 0.2μl、cmlA 0.9μl、flor 0.4μl,模板2.5μl,灭菌去离子水9.8μl;最佳反应程序为:94℃预变性5min;然后进入循环:94℃变性50S、54℃退火1min、72℃延伸1min,共32个循环,最后72℃延伸5min。 本研究对试剂盒特异性、敏感性、重复性和保质期进行了检测试验。结果表明:本试剂盒具特异性很强,只能特异性扩增出待检测的耐药基因;具有很高的灵敏度(2.4×10~4 CFU/mL);具有很好的重复性(100%);试剂盒在-20℃下的保质期为6个月。应用本检测方法和药敏试验方法对33株细菌的耐药性进行检测,结果表明,两者检出结果的符合率为91%。 本研究应用本试剂盒对全国21个省规模化养殖场收集的417株细菌进行了氯霉素耐药基因(cat1、cmlA、flor)的检测,结果显示,各省的耐药基因检出率差异较大,三种基因的平均检出率分别为:41.5%、35.7%和37.2%。 本研究率先在国内外建立了氯霉素类药物耐药基因(cat1、cmlA、flor)三重PCR检测试剂盒,并应用该试剂盒对417株细菌细菌进行了检测,了解了耐药基因在我国养殖场的分布情况,并为细菌氯霉素类耐药基因检测提供了可靠方法。


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