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青刺果体外抑菌活性及其活性物质的分离纯化与作用机制研究

蒲忠慧  
【摘要】: 青刺果(Prinsepia Utilis Royle),为蔷薇科扁核木属植物总花扁核的果实,具有降血糖、降血脂、增强免疫力、抗肿瘤、延缓衰老、抗菌等药理活性。近年来,国内外对青刺果的研究主要集中在食用和保健两大领域,对青刺果抑菌作用、抑菌活性成分及其抑菌机理的研究较少,且缺乏研究深度和系统性。为了开发新型植物源杀菌剂和充分利用青刺果资源,本研究探讨了青刺果粗提物对细菌的体外抑菌活性,系统预试了青刺果水提物化学成分并探讨了其抑菌活性的稳定性,在此基础上,采取生物活性追踪法对青刺果水提物进行了活性部位的筛选和活性成分的分离纯化及其对金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究。主要研究结果如下: 1.青刺果粗提物体外抑菌特性的研究:选择不同极性的溶剂(石油醚、乙醇和水)对青刺果抑菌活性成分进行提取,并采用体外抑菌试验筛选最佳抑菌提取物。结果表明,青刺果水提物、乙醇提取物、石油醚提取物得率分别为30.5%、18.2%和8.7%。浓度为800 mg/mL时,三种提取物的抑菌活性表现出明显差异,其中强极性的水提物抑菌能力最强,中等极性醇提物有一定的抑菌作用,低极性石油醚提取物抑菌能力最弱。可见,青刺果水提物是比较理想的抑菌活性部分。 抑菌率结果表明,不同浓度的青刺果水提物对三种标准菌的抑菌率大小为:金黄色葡萄球菌ATCC25923>大肠杆菌44102>沙门氏菌50041;对三种耐药菌的抑菌率大小为:浓度为253mg/mL时,金黄色葡萄球菌GL17>大肠杆菌EYAC08-56>沙门氏菌STQD2G,浓度为338~800mg/mL时,大肠杆菌EYAC08-56>金黄色葡萄球菌GL17>沙门氏菌STQD2G。 采用试管二倍稀释法测定青刺果水提物的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)。结果表明,青刺果水提物对三种标准菌(金葡球菌ATCC25923、大肠杆菌44102、沙门氏菌50041)的MIC值和MBC值分别为:25、25、50 mg/mL和25、50、100 mg/mL;对三种耐药菌(金葡球菌GL17、大肠杆菌EYAC08-56、沙门氏菌STQD2G)的MIC值和MBC值分别均为50 mg/mL和100 mg/mL。 2.青刺果水提物化学成分的系统预试及其稳定性研究:采用试管预试和薄层检测对青刺果水提物化学成分进行了系统预试,初步确定其含有:有机酸类、生物碱、黄酮及其甙类、内酯与香豆素、强心甙、萜类与甾醇类,可能含有皂甙,不含醌类。稳定性研究表明:青刺果提取物的抑菌效果受pH的影响较大,酸性条件下的抑菌效果较好,其中以pH值4~6为最好,热稳定性和紫外光辐射稳定性较好。 3.青刺果水提物抑菌活性部位的筛选:采用水提醇沉法、系统溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)萃取法对青刺果水提物进行分离,并通过活性追综筛选抑菌活性部位。结果表明,青刺果水提物通过醇沉初步纯化后,抑菌活性成分主要存在于上层乙醇溶液中,醇沉下来的多糖、蛋白质等大分子物质几乎无抑菌活性。 不同极性萃取物的抑菌活性表现为:乙酸乙酯萃取物对供试细菌均有一定的抑制作用,其抑菌活性显著强于其它萃取物(P<0.05);正丁醇萃取物和水部分在各设定浓度下对标准和耐药的金葡球菌、大肠杆菌均表现为抑制作用,在低浓度下(450 mg/mL)对标准和耐药沙门氏菌均无明显抑制活性;石油醚萃取物在各浓度下对标准和耐药沙门氏菌都无抑菌作用,对标准和耐药的金葡球菌、大肠杆菌均表现为抑制作用,但抑制作用相对较弱,显著低于其它萃取物的抑菌活性(P<0.05)。可见,青刺果水提物的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水部分具有较强的抑菌活性,其中乙酸乙酯萃取物的抑菌谱最广且抑菌活性最强。 4.青刺果水提物抑菌活性成分的跟踪分离与纯化:在活性跟踪下,采用硅胶柱层析法、大孔吸附树脂技术分别对青刺果乙酸乙酯萃取物抑菌活性成分进行分离与纯化。结果表明,乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱层析法得到七个部分,其中活性部分主要集中在前四部分。在浓度为200mg/mL时,前四部分对三种标准菌的抑菌圈均大于10 mm。其中第一部分经丙酮重结晶后有白色雪花状化合物A析出,经石油醚、氯仿、乙醇三种展开剂展层后均只有一个斑点。活性检测显示化合物A对三种标准菌的抑菌圈分别为14.03 mm、11.54 mm、12 mm,其MIC值和MBC值分别为1.25、2.5、20 mg/mL和1.25、5、大于20 mg/mL。 大孔树脂筛选结果发现AB-8树脂是分离纯化青刺果乙酸乙酯萃取物的最佳吸附剂。乙酸乙酯萃取物经AB-8大孔树脂洗脱后,抑菌活性成分主要被富集在30%醇洗部分,该部分对三种标准菌的抑菌圈位于19~21 mm之间,对三种耐药菌的抑菌圈位于17~20 mm之间。成分预试表明30%醇洗部分主要含生物碱、可能含有机酸和黄酮类化合物,于是对该部分通过酸水—碱化—亲脂性溶剂萃取法进一步纯化。活性追踪结果表明,30%醇洗部分纯化后的氯仿层部分抑菌效果较强,尤其对标准金葡球菌ATCC25923的抑菌效果最好,氯仿层部分对标准金葡球菌的MIC值和MBC值(6.25、6.25mg/mL)均低于30%醇洗部分对标准金葡球菌的MIC值和MBC值(12.5、12.5 mg/mL)。可见青刺果中抑菌活性物质可能与生物碱有关,还可能与黄酮、有机酸等有关。 5.青刺果活性部位的抑菌机理研究:以标准金葡球菌ATCC25923为指示菌,对青刺果活性部位的抑菌机制进行了初步探讨。透射电镜结果表明,青刺果使标准金黄色葡萄球菌菌体变形、细胞质不均匀、凝集成块、有些细胞质溶解出现空腔,细胞膜破裂,部分菌体细胞壁模糊不清甚至消失。因此,可以推测青刺果对金葡球菌的抑菌机理可能是破坏细菌细胞壁及细胞膜的完整性。


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