规模化鸡场健康鸡群产气荚膜梭菌的分离、鉴定及遗传多样性研究

【摘要】： 产气荚膜梭菌是一种导致动物肠道疾病的常见病原菌,通过产生各种毒素致病。为了调查产气荚膜梭菌在健康成年鸡群的流行现状,了解不同地区规模化鸡场产气荚膜梭菌的遗传多样性,分析其流行特点与地区差异的关系,本试验从四川省8个市区10个规模化鸡场分离得到了34株产气荚膜梭菌;首先采用多重PCR(Multiplex-PCR)确定分离菌株的基因型,进一步通过扩增片段长度多态性(Amplified Fragment LengthPolymorphism,AFLP)、肠道细菌基因间重复序列(Enterobacterial Repetitive IntergenicConsensus,ERIC)和重复性的基因外回文结构(Repetitive Extragenic Palindromic,REP)结合PCR技术对菌株进行基因亚型的比较分析,研究其遗传多样性。这对填补我国规模化鸡场产气荚膜梭菌的流行现状,型分布特点这一研究空缺,指导建立产气荚膜梭菌病的防治和诊断措施有重要意义。 1菌株的分离鉴定及耐药性分析——规模化鸡场健康鸡群产气荚膜梭菌的流行现状普查。从四川省成都、雅安、宜宾等8个市区10个规模化鸡场健康鸡群(成年鸡)采集了500个新鲜粪便和100个盲肠内容物样品,采用选择性培养基和紫牛乳鉴别反应分离得到了34株产气荚膜梭菌,检出率为5.7%,与国外相关报道相比分离率较低。菌株的药敏试验结果表明产气荚膜梭菌的耐药性明显,对青霉素、庆大霉素、万古霉素等均产生耐受。 2产气荚膜梭菌的基因型分析:采用multi-PCR确定菌株基因型,根据已报道的α、β、ε和ι毒素的基因序列设计引物,通过multi-PCR对分离菌株进行毒素基因型检测,结果发现:所有菌株均只扩增出一条400 bp左右的特异性条带,扩增产物测序结果和报道的α毒素序列完全一致,所分离产气荚膜梭菌的血清型均为A型。四川省的流行型别与国外报道不完全一致。该方法具有较高的特异性,可以从分子水平上对分离菌株进行鉴定,在流行病学调查以及预防诊断等方面都具有很大的应用价值和推广价值。 3产气荚膜梭菌的遗传多样性研究,进一步确定分离菌株的基因亚型:采用AFLP、ERIC-PCR和REP-PCR技术,对multi-PCR鉴定基因型为A型的分离菌株,进行分析确定其亚型。研究优化并建立了AFLP技术的最佳体系,并对结果进行了聚类分析。结果表明以相似性系数0.75为分类依据,共分为8个ERIC类群和12个AFLP类群,REP-PCR在相似性系数0.71处分为7个REP类群,均适合于产气荚膜梭菌的亚型分析。同时可见AFLP图谱能够较好地反映供试菌株的遗传特性,所有菌株在58%相似处聚在一起;在75%相似水平上被分为12个群。三种分型方法都表明不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显;而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型。可见,我国规模化鸡场健康鸡群产气荚膜梭菌的遗传多样性较低,其流行特点与地区差异密切相关。