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八种野生动物蛔虫的分子鉴定及两种蛔虫抗原基因的表达与免疫保护研究

何光志  
【摘要】: 野生动物是宝贵的自然资源,保护野生动物是全人类的共同责任。大熊猫、黑猩猩和白眉长臂猿均属世界濒危物种,小熊猫、北极熊、棕熊、马熊和四川黑熊为我国的二级保护动物。蛔虫是这些动物体内最常见、危害最严重的寄生虫,野生和圈养种群均可感染与发病,因此搞好大熊猫等珍稀野生动物蛔虫病的防治是保护野生动物的一项重要技术措施。 对动物蛔虫进行准确的分类鉴定是开展蛔虫生物学及防治等研究的基础性工作。蛔虫是一类宿主特异性较强的寄生虫。目前,对寄生于大熊猫和小熊猫等野生动物体内蛔虫的种类与分类地位尚存在一定的争议。过去对动物蛔虫的分类鉴定主要依赖于形态与生物学方法。由于宿主与地理环境等因素所导致的遗传变异,传统的形态与生物学分类研究方法在一些蛔虫近缘种的分类鉴定中的局限性日益明显。采用传统的形态学分类方法对蛔虫进行分类,很难准确地反映蛔虫种群的真正情况。长期以来,大熊猫等野生动物蛔虫病的防治均以药物驱虫为主,但驱虫药物均不同程度地存在副作用且长期使用可能产生抗药性等问题,因此也需要研究新的防治技术。 为了更好地防治野生动物蛔虫病,本研究运用寄生虫分子分类常用靶基因(ITS-2、ND1基因)对大熊猫、小熊猫等8种野生动物蛔虫的进行了研究,从而为以形态学为基础的传统分类提供DNA分子水平的依据。同时,本研究也分别采用RT-PCR扩增西氏贝蛔虫的Bs-Ag1、Bs-Ag2和似蚓蛔虫的A1-Ag1、A1-Ag2等抗原基因,构建原核表达载体进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行Western-blot分析和免疫保护研究,从而为研制西氏贝蛔虫和似蚓蛔虫基因工程疫苗的提供候选抗原。主要研究工作和结果如下: 1.大熊猫等八种野生动物蛔虫的ITS-2和ND1基因序列分析及系统发生关系研究 为了探讨野生哺乳动物蛔虫的分类地位。本研究测定了寄生在大熊猫、小熊猫、北极熊、棕熊、马熊、黑熊、黑猩猩和白眉长臂猿体内蛔虫的核糖体第二内部转录间隔区(ITS-2)和线粒体ND1基因碱基序列,分析了其碱基组成和序列间的同源性,结果表明:大熊猫、小熊猫和4种熊科动物蛔虫的ITS-2基因和ND1基因部分序列同源性分别为80.4%~99.7%和90.4%~98.6%;黑猩猩和白眉长臂猿体内蛔虫的ITS-2基因和ND1基因部分序列间的同源性分别为100%和99.2%。采用多种方法构后免疫小鼠,3次免疫后用似蚓蛔虫感染性虫卵攻击小鼠,7天后处死小鼠,取其肝脏和肺脏分离似蚓蛔虫幼虫,结果发现rAl-Ag1-FCA组幼虫回收率比对照组幼虫减少了69.34%(P<0.01),小鼠血清中IgG抗体显著升高(P<0.01)。研究结果表明rAl-Ag1可用于制各似蚓蛔虫基因工程疫苗。 5.似蚓蛔虫Al-Ag2基因的克隆表达和重组表达蛋白的免疫保护研究 利用RT-PCR方法从似蚓蛔虫感染性虫卵的总RNA中扩增出了似蚓蛔虫Al-Ag2抗原基因,该基因与猪蛔虫L2R37基因(AB089179)的序列同源性为96.0%。构建pET32a-Al-Ag2表达载体并在表达菌株BL21(DE3)中进行了诱导表达,经Western-blot分析其重组蛋白能被兔抗似蚓蛔虫阳性血清所识别。似蚓蛔虫Al-Ag2基因表达的重组蛋白纯化后与弗氏完全佐剂(FCA)混合液接种免疫小鼠,3免后用似蚓蛔虫感染性虫卵攻击小鼠,7天后处死小鼠,取其肝脏和肺脏分离似蚓蛔虫的幼虫,结果发现rAl-Ag2-FCA组小鼠的荷虫数比对照组幼虫减少66.84%(P<0.01),小鼠血清中IgG抗体显著升高(P<0.01)。本研究结果为似蚓蛔虫病的早期诊断及似蚓蛔虫基因工程苗疫苗的研制奠定了基础。


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