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中国荷斯坦奶牛β-防御素基因LAP分子克隆及真核表达初步研究

袁曦  
【摘要】: 防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,它在先天性免疫系统宿主防御机制中起着重要的作用。研究发现一些β-防御素基因在奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达,表明在乳房炎发生时β-防御素可能在乳腺局部防御中发挥作用。本研究进行了β-防御素基因LAP的克隆与序列分析,构建了LAP基因的真核表达载体,并成功进行了真核融合表达。 实验以患乳房炎的中国荷斯坦奶牛乳腺为材料,提取乳腺上皮细胞总RNA,根据GenBank中注册的牛β-防御素基因LAP的cDNA序列设计了5'端带有EcoRI和BamHI酶切位点的一对引物,采用RT-PCR技术扩增LAP基因的cDNA序列,并将其连接到pMD~(TM) 19-T Simple载体中进行序列测定,将测序鉴定正确的克隆质粒命名为pMD19-T-LAP。生物信息学分析结果表明,本研究成功扩增出牛β-防御素基因LAP的编码区序列,大小为195bp,推导该序列编码64个氨基酸,并含有β-防御素的特征性分子结构即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基(C)。与已报道的牛β-防御素基因LAP cDNA(登录号:EF630358.1)序列进行比较,核苷酸同源性达98%,有三个碱基发生了变异,分别为核苷酸序列第196的A-G突变、第199和201位的T-C突变;氨基酸同源性为95%,三个突变碱基引起第63位Arg→Lys的变异,这种核苷酸的序列差异,可能是由于牛的不同品种之间的差异造成的。 用EcoRI和BamHI双酶切重组克隆质粒pMD19-T-LAP,然后插入到pEGFP-C1载体的EcoRI和BamHI位点,构建了真核表达重组质粒pEGFP-C1-LAP,经质粒PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明重组表达质粒pEGFP-C1-LAP构建成功。利用脂质体转染技术,将重组质粒转化到COS7细胞系,用荧光显微镜检测到增强型绿色荧光,分别提取重组质粒组和空载体对照组转染后细胞的总RNA,经RT-PCR检测表明重组质粒组LAP基因mRNA已经在COS7细胞内得到转录。 本试验结果为进一步研究奶牛β-防御素基因LAP的表达特性、基因功能及表达产物的抑菌活性奠定了一定的基础,同时重组多肽治疗和预防奶牛乳房炎提供了基础资料。


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