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桃种胚的离体培养及再生植株的RAPD分析

潘雪涛  
【摘要】: 桃种子中存在一定频率的非正常种子,本研究以这种非正常种子为试材,建立了桃胚离体再生体系,并运用RAPD技术对再生的非正常种子苗进行遗传多样性分析。主要研究结果如下: 1.外植体表面灭菌处理:先用75%的酒精处理30s,再用0.1%升汞处理10min,最后再用无菌水清洗5次的灭菌处理效果最佳,种胚污染率15.52%,种胚成活率可达81.03%。 2.种胚的启动萌发:MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.25mg/L最有利于种胚的萌发,萌发率96.67%,且萌发的芽苗有大量侧芽,平均芽苗数达2.54个,增殖倍数达3.9,利于后阶段的继代增殖培养。 3.在继代增殖:MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.3mg/L最利于组培苗的继代与增殖,增殖倍数为3.73。此配方既能保证较高的增殖率,又能保证较好的芽苗质量,且玻璃化率和褐化率最低。 4.壮苗和生根培养:(1)最佳的壮苗培养基配方为:Ca元素加倍的MS+IBA0.3mg/L+6-BA0.75mg几,并加入0.2mg/L的PP_(333),平均芽苗高度可达2.98cm,且芽苗质量最优,能为接下来的生根培养提供壮苗。(2)最佳生根诱导处理方法为:用浓度为100mg/LIBA浸蘸30min后,接种于含0.1%活性碳的1/2MS培养基上,16℃暗培养7天后再转入25℃光照下培养,见光后1周内可生根,生根率80%,每株平均生根数达6.50条,平均根长7.13cm。 5.炼苗移栽:采用“三步炼苗法”,最终成活率达到70%。 6.本研究采用改良CTAB法提取DNA。PCR采用25μl反应体系:其中引物浓度2μmol/L,Mg~(2+)的浓度为25mmol/L,dNTP的浓度为10mmol/L,Taq酶浓度为2.5U,Buffer25mmol/L,DNA模板浓度为40ng。反应程序为:93℃2min,36℃1min,72℃2min,1次循环;93℃1min,36℃1min,72℃2min,42次循环;93℃1min,36℃1min,72℃10min,1次循环。扩增完毕后4℃保存,于1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。 7.从62个随机引物中筛选出了20个条带数量多且清晰、多态性好的随机引物作为本试验的PCR扩增引物,其中12个引物表现出了遗传多样性。总共得到2621条清晰谱带,其中非正常种子苗扩增条带1465条,得到特异性谱带248条,占总条带数的9.44%,占非正常种苗条带的16.89%。分子标记显示:正常种子苗与非正常种子苗之间存在特异性条带,而正常种子苗间却未表现出差异,且播种繁殖和组织培养所得的非正常种子苗表现出了相同的特异性条带,表明特异性条带的出现来自非正常种子本身,而非组织培养过程中诱变造成的,即外形非正常的种子的确存在丰富的遗传多样性。


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