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玉米microRNA的计算机预测与克隆及在干旱下的差异表达分析

陈旭  
【摘要】: MicroRNA(简称miRNA)作为真核生物体内一类负调控因子,在生物体内所起的调节作用几乎涉及到所有的细胞分子水平。越来越多地研究表明,miRNA与植物抗逆性有密切关系,尤其是在拟南芥、水稻等植物中的研究,更提示了miRNA对逆境调节的重要作用。但是,关于玉米miRNA的鉴定及其与逆境胁迫的关系研究还较少,在miRNA数据库中玉米miRNA序列被登陆记载的仅有98条,有关miRNA对玉米发育代谢及逆境调节作用的报导更少。因此,为了探索miRNA与玉米干旱应答机制的关系,本研究以强耐旱自交系“87-1”和不耐自交系“200B”为材料,用聚乙二醇6000(18%)模拟干旱处理,利用生物信息学与基因克隆两种方法,寻找并鉴定玉米干旱胁迫下表达的miRNA,并进一步对这些miRNA的靶基因进行预测。再根据miRNA在干旱处理下的表达特性,寻找miRNA与玉米干旱应答机制的关系。主要研究结果如下: 1.通过计算机预测法和基因克隆法共找到18条玉米新miRNA。计算机预测到了11条,克隆法得到了7条,这些miRNA的核苷酸主要集中在19-21nt范围内,且5'端第一个核苷酸为“U”的有7条,这些特点和其它已鉴定的植物miRNA一致。 2.多数新发现的miRNA与禾本科单子叶植物中的miRNA存在较高的同源性。计算机预测的11条miRNA有5条与水稻、小麦存在较高的保守性;克隆法中得到的7条miRNA,有4条与水稻、小麦存在较高的保守性。 3.通过RT-PCR法验证了其中11条miRNA是真实存在的。在干旱处理下,提取200B和87-1叶片小RNA,通过加尾和引物延伸PCR,对18条候选miRNA进行真实性验证。结果发现11条miRNA在两个自交系中各有表达,其中在87-1中的表达多于200B。克隆法得到的7条全部得到验证;计算机预测的11个miRNA只有4个得到验证。 4.从正常浇水对照与干旱处理比较来看,验证的11个miRNA中有7条miRNA,分别是miRNA1、miRNA3、miRNA6、miRNA479、miRNA782、miRNA815a和miRNA820均在“87-1”干旱胁迫下表达,正常浇水对照和“200B”中未见表达。说明这7个miRNA与玉米耐旱应答机制有关。 5.利用miRU软件,预测了11个已鉴定miRNA中的8个miRNA的12个靶基因。这些靶基因主要涉及生物的转录调控、信号传导、逆境胁迫、跨膜运输及新陈代谢等途径。从耐旱材料87-1干旱处理中鉴定的miRNA,其靶基因分别编码CDC2/CDC28蛋白激酶(Cell division cycle 2/Cell division cycle28蛋白激酶)、类受体蛋白激酶、扩展蛋白、多萜醇、cerberus 1(CER1)、钙调蛋白激酶(CBL interactingprotein kinases,CIPKs)等与玉米耐旱调控有关的蛋白(酶)。


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