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杨树花及其复方制剂药学与临床应用研究

房春林  
【摘要】: 杨树花(Flos popul)为杨柳科(Salicaceae)植物毛白杨(Populus tomentosa)、加拿大杨(Populus canadensis)或同属树种植物干燥雄花序,性味苦寒,具有清热解毒,化湿止痢之功效。但因目前缺乏对杨树花药理、药效及毒理学等方面的系统研究,其主要活性物质的化学成分也尚不清楚,因此局限了杨树花在兽医临床上的开发利用。本研究将杨树花(毛白杨雄花序)与黄芩复方,研制了杨树花复方注射液,对其制备工艺、药理、毒理、质量标准及临床应用等方面进行了系统研究。主要研究内容和结果如下: 1、采用试管法和薄层层析方法对杨树花水提液和水提液的乙酸乙酯及正丁醇萃取物的化学成分进行初步检识,结果表明,杨树花水提液中主要化学成分包括多糖、黄酮类、有机酸、强心甙、内酯及香豆素,蒽醌类化合物、酚类或鞣质;可能含有生物碱,不含有皂苷、甾醇、三萜类;乙酸乙酯萃取液中含有化学成分与水提液中基本一致;而正丁醇萃取液含有黄酮、内酯及香豆素、有机酸和鞣质。 以总黄酮含量为考察指标,采用水提醇沉法和醇提法对杨树花提取工艺进行研究,并按L9(43)正交试验设计对杨树花水提醇沉工艺进行优化,优化后的提取工艺条件为:提取溶液PH为7,煎煮提取2次,提取时间为2h,醇沉过程中乙醇浓度为65%,超滤液浓度小于1.5g/mL(按原生药计),超滤温度为15-45℃,压强大于0.05Mpa。 采用大孔吸附树脂和硅胶层析方法对杨树花中水杨苷进行了提取分离和纯化,结果表明,经过大孔吸附树脂和硅胶柱层析后,所得水杨苷纯度分别为24.17%和96.23%并建立了HPLC方法检测其含量,以C18色谱柱,乙腈-水(7:93)为流动相,检测波长为270nm,柱温25℃,水杨苷在0.025μg-4.0μg(r=0.9994)之间呈现良好线性关系。2、采用药敏实验、联合抗菌作用实验、抗细菌感染实验及抗炎实验方法,对杨树花提取物及复方制剂的药理作用进行了研究。结果显示,大肠杆菌、沙门氏菌的标准菌和致病菌对杨树花水提液及其复方制剂均表现出了中度敏感,大肠杆菌、沙门氏菌标准菌对杨树花水提液乙酸乙酯及正丁醇萃取物也表现出了中度敏感,但沙门氏菌致病菌对杨树花水提液乙酸乙酯及正丁醇萃取物表现为低敏;杨树花与黄芩联合抗菌具有相加作用。抗细菌感染及抗炎实验结果证实,杨树花水提液及复方制剂在体内对大肠杆菌具有抑菌作用,高、中、低剂量的杨树花水提液均可使小鼠耳肿胀度明显降低,其抑制率分别为65.0%、58.9%和51.6%,与对照组相比,差异极显著(P0.01);同时高、中剂量组对小鼠腹腔毛细血管通透性即化学性腹膜炎具有较好的抑制作用,其抑制率分别为57.02%和53.84%,与对照组相比,差异极显著(P0.01),而低剂量组效果不明显,其抑制率仅为5.06%。对小鼠免疫器官影响试验结果表明,杨树花单方制剂高、中、低剂量组可显著提高小鼠的脾脏及胸腺指数,与对照组相比,差异极显著(P0.01);表明,杨树花提取物及复方制剂具有明显的抑菌、抗炎作用。 3、参照农业部新兽药一般毒性实验技术要求,对杨树花复方制剂进行了急性毒性和亚慢性毒性试验,结果表明,杨树花复方注射液LD50为46.4g/kg体重,95%可信区间为46.40±10.22g/kg,亚慢性毒性试验结果表明,高、中、低剂量三组小鼠连续28天腹腔注射给药后,一般情况、体重增长速度、血液学指标、血液生化指标与正常对照组比较均无明显差异,说明在上述剂量下(相当于临床给药剂量的50倍),杨树花注射液连续腹腔注射28天无明显毒性反应,兽医临床用药是安全的。 4、通过对杨树花复方注射液制剂助溶剂、抗氧化剂的筛选及PH值范围的确定来探讨杨树花复方制剂的制备工艺,并采用留样观察法对制剂的稳定性进行考察。结果表明,以二甲基乙酰胺为助溶剂,亚硫酸钠或亚硫酸氢钠为抗氧化剂,PH范围为6.5-7.5时,制备的复方制剂稳定性好,常温(25℃)条件下可保存1年。同时对杨树花复方制剂的质量标准进行了研究,采用HPLC方法检测复方制剂中黄芩苷的含量,结果显示,此检测方法简单,结果准确。 5、采用药敏试验检测从临床分离的猪源大肠杆菌的耐药性,并同时采用二重PCR方法检测从临床分离的猪源大肠杆菌的耐喹诺酮类和磺胺类药物的主要耐药基因GyrA和Sul2基因,并以此临床分离耐药细菌为受试菌,以杨树花复方制剂为耐药性消除剂进行体外耐药性消除试验,并观察消除前后细菌生长情况、细菌的最小抑菌浓度的变化。同时通过分析大肠杆菌耐药菌消除前后质粒电泳图谱的变化及耐药基因GyrA和Sul2基因的碱基和氨基酸序列变化来探讨耐药性消除机理。结果表明,临床分离的猪源大肠杆菌对恩诺沙星及磺胺嘧啶具有很强的耐药性,二重PCR方法也检测到了耐喹诺酮类和磺胺类药物的主要耐药基因GyrA和Sul2基因,表明所分离菌为耐药菌。耐药消除试验结果表明,杨树花复方制剂对耐恩诺沙星和磺胺嘧啶大肠杆菌的耐药性具有一定的消除作用,其消除率分别为19.5%和18.18%,而对照组消除率为0,经消除后的细菌生长速度明显减慢,对恩诺沙星和磺胺嘧啶的MIC值也明显降低。耐药性消除前后细菌质粒电泳图谱条带数无变化,同时GyrA和Sul2基因序列分析表明,消除前后两耐药基因的碱基及氨基酸序列均无明显变化。 6、为验证杨树花复方注射液对仔猪大肠杆菌病的临床治疗效果,对人工感染仔猪大肠杆菌进行临床治疗试验。结果表明,高、中、低剂量的杨树花复方注射液对人工感染的仔猪大肠杆菌病均有较好的治疗效果,其治愈率分别为90%、90%、80%。穿心莲注射液对照组治愈率为60%。临床扩大试验结果表明,杨树花复方注射液对仔猪大肠杆菌病有效率为97.14%,治愈率为84..28%,死亡率为2.86%。表明杨树花复方注射液对仔猪大肠杆菌病具有较好的临床治疗效果。


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