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玉米海藻糖-6-磷酸合成酶基因家族的功能验证和差异表达分析

蒋伟  
【摘要】: 海藻糖(Trehalose),是由两分子的葡萄糖以α,α-1,1糖苷键连接而成的非还原性二糖,广泛存在于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物和植物中。微生物在极端条件下大量积累海藻糖来保护蛋白质、核酸和生物膜等生物活性物质。除在某些复苏植物中有较高的积累量外,海藻糖在高等植物中的积累量都极低。但是,海藻糖及其前体海藻糖-6-磷酸在胚胎发育、花序建成、细胞形态建成和信号转导方面发挥着重要的作用。转入外源海藻糖合成相关基因的植株,虽没有海藻糖的大量积累,但其耐逆性都得到了提高。过量表达内源海藻糖合成酶基因的转基因拟兰芥和水稻,耐逆性也得到了提高。因此,研究玉米内源海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因家族的功能,可以解明玉米低海藻糖含量的机理,为转化利用外源TPS基因和过量表达内源TPS基因奠定基础。 本研究通过对已测序玉米自交系“B73”基因组BAC文库的搜索,发现玉米基因组中含有多达18个TPS基因的拷贝。将18个TPS基因拷贝在基因组序列上定位后发现,实际上只有12个碱基序列有一定差异的同源基因,根据其与酵母TPS1的同源性分别命名为TPS1~TPS12。其中,TPS3为三拷贝基因,TPS2、TPS4、TPS5和TPS11为双拷贝基因,TPS1、TPS6、TPS7、TPS8、TPS9、TPS10和TPS12为单拷贝基因。按照拟南芥TPS基因家族划分方法,将玉米的TPS基因家族划分为两个亚家族,TPS1属于Ⅰ亚家族,TPS2~TPS12属于Ⅱ亚家族。根据上述序列设计特异PCR引物,以玉米自交系“18-599”的cDNA为模板,同源扩增TPS基因家族12个成员的开放阅读框(open reading frame, ORF)。经克隆测序和比对分析发现,扩增出其中9个同源基因。TPS1的ORF全长2820 bp,编码939个氨基酸;TPS2的ORF全长2607 bp,编码868个氨基酸;TPS3的ORF全长2592 bp,编码863个氨基酸;TPS4的ORF全长2673 bp,编码890个氨基酸;TPS5的ORF全长2739 bp,编码912个氨基酸;TPS6的ORF全长2595 bp,编码864个氨基酸;TPS7的ORF全长2736 bp,编码911个氨基酸;TPS8的ORF全长2568 bp,编码855个氨基酸;TPS9的ORF全长2556 bp,编码851个氨基酸。Ⅰ亚家族的TPS1与Ⅱ亚家族的各同源基因编码蛋白的氨基酸序列相似性较低,介于33%-36%之间。Ⅱ亚家族各同源基因之间,编码蛋白的氨基酸序列相似性较高,介于51%-94%之间。其中,TPS5与TPS7的相似性高达91%,TPS8与TPS9的相似性高达94%。为验证这9个同源基因的功能,分别将9个ORF序列插入酵母表达载体pRS6,转化酵母TPS1基因突变菌株YSH290 (tps1△)和TPS2基因突变菌株YSH450(tps2△),分别在葡萄糖筛选培养基和38.6℃高温条件下筛选,进行功能互补实验。结果证明,9个TPS基因中,TPS1和TPS3编码的蛋白具有TPS活性,TPS3和TPS4编码的蛋白具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶(Trehalo-6-phosphate phosphatase, TPP)活性。 将玉米自交系“18-599”的幼苗从二叶期开始进行水培,三叶期进行150mmol/L NaCl和12℃低温胁迫处理,于0(对照)、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48 h分别取根系和叶片,用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)以及逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR),检测上述9个TPS同源基因在逆境胁迫下的表达差异。结果表明,9个TPS同源基因在根系和叶片中的表达均受高盐和低温胁迫诱导。在高盐胁迫下,除TPS4在叶片中受到一定程度的抑制外,其他8个同源基因分别在胁迫处理的不同时间段上调表达。在叶片中,TPS1、TPS2、TPS3和TPS5分别在低温胁迫处理的不同时间段上调表达,TPS4在所有时间段下调表达,TPS6、TPS7、TPS8和TPS9在低温胁迫处理初期下调表达,在胁迫处理后期上调表达。在根系中,TPS1、TPS3和TPS4均在低温胁迫下上调表达。由此说明,玉米TPS基因家族的一些成员可能具有表达活性,参与了胁迫信号转导,所以才会对高盐和低温诱导产生应答反应。 在对TPS1基因的ORF重复测序中,发现不同克隆的序列组成不尽相同,推测可能存在可变剪接。因此,以高盐和低温胁迫处理24 h以及0 h对照的叶片cDNA为模板,重新扩增其ORF,进行大量重复测序。TPS1基因在非胁迫下产生两种剪接体:TPS1和TPS1A;在盐胁迫和低温胁迫下产生5种可变剪接体:TPS1、TPS1A、ZTPS1B、TPS1C和TPS1D。经ORF finder和Conserved domain analysis软件分析,TPS1剪接体可编码TPS和TPP两个结构域,与其他高等植物中发现的TPS基因转录本编码结构域的情况相同。与TPS1相比,TPS1A的可变剪接属于内含子保留型,TPS1中的第4、7、8内含子滞留在了TPS1A成熟的mRNA中,可编码369个氨基酸的蛋白;TPS1B属于5’端剪接位点的选择型,在第7内含子的剪接过程中,采用了末端剪接位点,可编码462个氨基酸的蛋白;TPS1C属于内含子保留型,滞留了TPS1中的第4内含子,可编码369个氨基酸的蛋白:TPS1D的可变剪接较为复杂,第1内含子的剪接同时采用了5’端和3’端剪接位点的选择两种形式,同时也存在盒式外显子,成熟的mRNA中不包括TPS1中的第7外显子,可编码133个氨基酸的蛋白。多序列比对分析表明,后4种可变剪接体有一个共同的特性,即将TPS1编码蛋白中融合在一起的TPS和TPP两个结构域分开,可能使其TPS结构域具有更高的催化活性。 综上所述,玉米TPS基因家族成员较多,大多具有转录产物,在逆境胁迫下差异表达,并存在可变剪接,编码蛋白有些具有海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性,可能参与逆境胁迫信号转导。


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16 韦宇拓,朱绮霞,罗兆飞,陈发忠,李桂媛,黄鲲,黄日波;耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2004年11期
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