玉米应答低磷胁迫的消减文库构建及部分EST序列分析

【摘要】： 磷是植物生长发育不可缺少的大量元素之一,直接参与植物体内各种重要的生理生化过程,对促进植物生长发育和新陈代谢及提高产量起着重要的作用。土壤中磷的总含量非常丰富,但在酸性条件下磷会迅速与阳离子尤其是铝和铁离子形成不溶性化合物,致使磷不易被植物吸收,因此土壤缺磷是全球性的问题。土壤中可利用磷的浓度虽然很低,植物在长期适应低磷环境的过程中,已经进化出了一整套适应机制,包括形态、生长发育、生化和遗传上的变化。玉米耐低磷的研究逐渐深入,从耐低磷基因型筛选、形态、生理生化改变到耐低磷遗传性状分析、QTL定位。但有关玉米耐低磷胁迫下的基因调控和耐低磷分子机制方面的研究报道还较少。 本研究以耐低磷玉米自交系178为材料,进行正常培养和低磷胁迫处理。以低磷处理开始时间为原点,在低磷胁迫6h、12h、24h、48h、72 h五个时间点取对照和处理玉米的根系,提取总RNA。然后采用抑制消减杂交技术构建玉米根系应答低磷胁迫差异表达基因正向及反向文库,经测序和生物信息学功能比对后根据其同源序列基因的功能推测EST序列的功能并进行分类注释；运用RT-PCR半定量表达技术,研究具有重要功能的基因在玉米耐低磷响应过程中的表达模式；运用元分析方法及生物信息学手段,将单拷贝的EST序列和低磷胁迫相关QTL位点进行共定位分析,探讨二者之间的吻合程度,分析具有重要遗传效应和育种潜力的EST序列。取得以下研究结果：1.通过SSH技术和文库构建技术,构建了玉米自交系178根系耐低磷差异表达基因正向文库和反向文库,分别包含3648个和2498个克隆。文库中插入的cDNA片段长度介于100-500 bp之间。 2.从正反向文库中分别选取103个和15个阳性克隆测序后,经生物信息学比对后,共获得65条唯一的EST序列,其中已知基因功能的EST序列44条,未知功能的EST序列21条。根据生物信息学比对同源序列基因的功能并结合前人的研究,将已知基因功能的44条EST序列分为九类：能量代谢类(2条,3%)、氨基酸和蛋白质代谢类(18条,28%)、磷素循环类(4条,6%)、信号转导类(3条,5%)、细胞分裂和组成类(2条,3%)、胁迫相关类(5条,8%)、蛋白质互作类(1条,1%)、转录调控类(7条,11%)和通道蛋白类(2条,3%)。结果表明,低磷胁迫下的玉米根系表现出能量代谢加剧、蛋白质合成的增加、转录调控加强、有机态磷的分解利用增加和磷素消耗压缩,发现根细胞中存在多条信号转导途径,生长素合成增加导致细胞分裂加快,根细胞加强了保护机制以应对低磷胁迫对细胞产生的威胁。 3.通过生物信息学比对,从65条EST序列中获得24条单一拷贝EST序列,将单一拷贝EST序列与已报道的低磷胁迫相关QTL位点都定位在玉米染色体图谱上,共定位分析表明,45.8%的单拷贝EST序列与QTL位点重叠,表明运用SSH构建的低磷胁迫基因差异表达文库,能筛选较高比例的具有显著遗传效应的低磷应答相关基因,具有一定可靠性和合理性。可以预见,随着EST序列和QTL位点信息的增加,两者相互之间的共定位区域会更加明显。 4.采用半定量RT-PCR方法,研究来自不同类型的5个重要功能的基因各时间段的表达情况。结果发现五个基因表达量在总体上都呈上升的趋势,但具体到各个时间段的表达上又有所差别。根据5个基因表达量上调的时间和增幅的大小,可以初步认为玉米根系中5个耐低磷相关基因的表达顺序为：紫色酸性磷酸化酶前体基因(PAP)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GCS)、假定myb1靶序列基因(TOM)、蛋白质二硫键异构酶基因(PDI)和生长素诱导蛋白基因(AIP),表明低磷胁迫下玉米根系内的生理生化变化发生在先：磷的亏缺首先促发对磷的需求压力,然后引发细胞内外环境失衡,需要大量合成相关蛋白质和启动耐低磷下游基因的调控子,最后生长素诱导蛋白大量合成引发了根构型改变,因而根构型等形态变化发生在后,这一结果与田间观察结果以及前人研究结果基本吻合。 5.本研究运用SSH获得的结果与前人运用基因芯片、蛋白质组分析、cDNA-AFLP等方法的研究结果相互映证,也与谷俊涛等(2009年)在小麦上的研究结果、李利华等(2009年)在水稻上的研究结果相似。由此可见,运用SSH技术构建低磷胁迫差异表达基因文库、研究玉米耐低磷的机理具有较高的可靠性和合理性。 6.从整体看玉米低磷胁迫响应涉及根系形态结构、能量代谢、物质代谢、信号转导、转录调控、物质运输等多个方面基因,各方面基因间相互作用、密切联系,共同构成了玉米低磷响应的基因调控网络,这与前人的研究结果相一致。 7.低磷胁迫下玉米根系内的响应过程是一个基因顺序启动的过程：首先是磷素循环类基因的启动,然后是胁迫相关类、氨基酸蛋白质代谢类、生长素合成相关基因和转录调控靶序列基因的启动,较晚启动的是根细胞分裂和组成类。本研究中基因的启动顺序与田间观察和前人研究结果中低磷胁迫下玉米根系内的生理生化变化发生在先,而根构型等形态变化发生在后的变化趋势基本一致。 8.本研究推测耐低磷玉米的核心适应能力表现在磷素循环、细胞保护和根构型三个主要方面,与前人研究的小麦、水稻耐低磷机制有相似之处。耐低磷玉米三方面的核心适应能力与信号传导系统、转录调控系统、氨基酸蛋白质合成系统和能量物质代谢一起组成的调控网络是玉米适应低磷环境的机制。