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柳枝稷种质资源评价、分子标记开发及遗传连锁图谱构建

黄琳凯  
【摘要】: 柳枝稷(Panicum virgatum)为禾本科(Gramineae)黍属(Panicum)多年生暖季型丛生禾草(C4),原产于北美大草原。由于其具有较高潜力的生物产量和低要求的水分、营养输入使其成为能源植物的首选。本研究以柳枝稷种质资源为对象,利用SSR和SRAP分子标记及细胞流式仪研究了其遗传背景,并评价了其生产性能,抗锈病和抗炭疽病能力,在此基础上选择在株高、抗锈病性等方面存在明显差异的亲本(Alamo、Dacotah)构建作图群体,开发并利用EST-SSR、RGA-SNP标记联合SRAP标记用于遗传连锁图谱构建,并对柳枝稷抗锈病进行QTL分析。取得以下结果: 1、为研究柳枝稷及其近缘种的遗传关系和遗传多样性,对美国国家基因库中来自22国家的黍属22个物种种质资源进行了SRAP和SSR分析。结果表明,黍属种质资源蕴含了丰富的遗传多样性,基于SRAP数据,多态性条带比率为96.74%, shannon多样性指数为0.463;基于SSR数据,多态性条带比率为94.73%,shannon多样性指数为0.424。大部分的遗传变异存在于黍属物种间(70.02%基于SRAP结果,73.35%;基于SSR结果),所有的黍属种质资源能被SRAP或者SSR区分开。同时SRAP显示了比SSR更高的效率。来自于同一物种的不同材料聚类在一起,但不能反应的材料的地理来源。此外,研究还发现Panicum amarum和柳枝稷亲缘关系较近,为其资源的杂交改良提供了理论参考。 2、采用SRAP标记对来自美国的94份柳枝稷种质资源的遗传多样性进行了分析。共筛选出了20对SRAP引物组合共扩增出209条带,其中多态性条带167条,多态性条带比率为79.9%,平均每对引物扩增出条带11条,多态性条带8.79条,shannon多样性指数为0.241。利用流式细胞仪分析检测了部分柳枝稷种质资源倍性水平,结果表明,低地型材料全部是四倍体,高地型材料中大部分为四倍体(79.06%),发现了8个八倍体(18.60%)和一个十倍体材料(2.33%)。聚类分析表明,柳枝稷按照其生态型可分为两大类即低地型和高地型,但在高地型类群中,八倍体材料没有聚在一起。 3、针对单株生物产量、茎叶比、抗锈病和抗炭疽病性状评价了122个柳枝稷种质资源的生产性能。结果表明,绝大部分柳枝稷种质资源在该地区容易感染锈病菌。并发现低地型柳枝稷种质资源表现明显好于高地型种质资源。通过综合评价,筛选出三个表现较好的种质资源即:Alamo, TEM-LoDorm, Kanlow. 4、从NCBI数据库下载近20万条柳枝稷EST序列,用SSRIT搜索得到含SSR并且长度大于18bp的EST有587条。在587个SSR中,包括21.47%的二核苷酸重复,56.22%的三核苷酸重复,2.04%的四核苷酸重复,3.41%的五核苷酸重复和16.87%的六核苷酸重复。其中CGG/GCC(12.27%)和GCG/CGC(10.05%)出现的频率最高。用这587条EST序列设计了587对EST-SSR引物,并用构图亲本Alamo和Dacotah检测引物的扩增情况,其中433(73.25%)对引物得到强且清晰的PCR产物,123(20.95%)对引物在两个品种间具有多态,51(8.69%)对引物能在F1群体中产生多态条带。 5、在NCBI中利用blast工具以水稻RGA序列在柳枝稷EST中寻找到190条柳枝稷RGA序列,设计了190对引物,在构图亲本构图亲本Alamo和Dcotah中有78对成功扩增清晰条带(41.06%)。通过对RGA-PCR产物直接测序,成功测序有90条序列,测序成功率为57.69%。在90条RGA序列中共得到18090bp的序列,发现了个249SNP,平均61.5bp一个SNP。并利用这些SNP并开发得到了15个RGA-CAPS或者RGA-dCAPS标记。 6、采用EST-SSR、SRAP和RGA-SNP技术体系,以低地型品种Alamo和高地型品种Dacotah杂交所得的F1代165个单株为作图群体,进行连锁图谱的构建。共得到139个标记符合孟德尔分离比例(1:1),采用Map Manager QTX b20软件进行连锁分析,分别构建了Alamo和Dacotah的分子连锁框架图,其中母本图谱包含26标记,覆盖9个连锁群,总图距为452.9cM,标记间平均距离为17.42cM。父本图谱包含32个标记,覆盖11个连锁群,总图距为541.43cM,标记间平均距离为16.92cM。应用复合区间作图法分析该组合165个F1单株的抗锈病能力,得到一个抗锈病性状的数量基因座(QTL),位于第五连锁群,可解释9.61%的遗传变异。同时我们也发现六个标记和抗锈病表型数据有显著的相关性。


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