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伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

李宇  
【摘要】: 本研究以猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离SL株为材料,分子克隆gE基因全序列并进行生物信息学分析,选择gE基因主要抗原表位区片段进行原核表达载体构建、原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立。 1.gE基因的分子克隆与生物信息学分析 参照GenBank中登录号为NC_006151的gE基因序列,以四川分离的PRV SL株为材料,TA克隆到,pMD19T-Simple Vector,构建重组克隆质粒pMD-gE,经酶切鉴定和序列测定,克隆出长为1964 bp的基因片段,其中包含1734 bp的gE基因完整阅读框,编码578个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外不同来源的10个毒株进行生物学信息分析,核苷酸序列同源性在97.5%~100.0%之间,氨基酸同源性在94.8%~99.8%之间,不同PRV毒株间gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。分析得知,gE基因密码子中G、C出现频率较高,分别占了40%和30%,出现频率最高的四个密码子为GGG、GAC、CTG和CGC,且GC3s含量达96.89%,证明该基因对于G、C具有明显的偏爱性;二级结构分析,主要以转角和无规卷曲为主;通过疏水性分析和跨膜区预测,gE蛋白包含两个疏水区,第一个疏水区(3~25位氨基酸残基处)为信号肽,第二个疏水区(429-452位氨基酸残基处)跨膜一次,N端位于膜外侧,C端位于膜内侧;抗原位点预测分析,gE基因的抗原表位大部分位于N端300个氨基酸内。 2.gE基因主要抗原表位区原核表达载体构建及活性检测 以pMD-gE重组质粒为模板,设计一对引物,PCR扩增出gE基因主要抗原表位区(mgE)(包含52-263氨基酸残基片段),TA克隆到]pMD19 T-Simple Vector载体上,构建克隆重组质粒pMD-mgE,将阳性克隆菌送公司测序,测序结果与模板中对应序列完全一致。用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶定向克隆到]pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-mgE,然后转化高效表达菌E.coli Rosetta TM(DE3)进行表达研究。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测显示,在约42 Ku处出现一条特异带,Western-Blot检测显示表达的融合目的蛋白具有特异的反应原性。 3.gE基因表达蛋白的纯化及其ELISA检测方法的初步建立 对诱导表达后以包涵体形式存在的mgE重组蛋白进行纯化,作为包被抗原,并对抗原的包被,作用时间及底物选择等条件进行优化,最后通过特异性试验、重复性试验、阻断试验以及和与标准试剂盒对比等方法检验已建立的ELISA方法效果,初步建立了猪伪狂犬病病毒抗体的gE-ELISA检测方法。结果表明,ELISA最佳工作条件为:重组抗原最适包被质量浓度为8.3ug/mL,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度为1:40,血清和酶标二抗的反应时间分别为37℃下90 min和60 min,反应底物用TMB溶液,37℃显色10 min;统计学分析后确定阴阳性的临界值为0.32。各项检测试验的结果表明此方法特异性强、重复性好、敏感度较高;将建立的ELISA方法与美国IDEXX公司PRV抗体检测试剂盒相比较,其相对特异性和敏感性分别为98.1%和91.5%,符合率达到90.0%,检测结果无显著性差异。 本试验克隆并表达了PRV gE基因中抗原集中的一个基因片段,初步建立了间接ELISA检测方法。从生物信息学、分子生物学、免疫原性等方面对gE基因进行了研究,为PRV的深入研究提供了参考。


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