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奶牛β-防御素TAP基因克隆及乳腺特异性表达载体构建

栾红雨  
【摘要】: 防御素在机体先天性免疫系统防御机制中发挥重要作用。乳腺炎可诱导奶牛乳腺组织中β-防御素增量表达,使患乳腺炎局部防御作用增强,表明在乳房炎的发生和防御过程中β-防御素发挥重要的作用。用乳腺生物反应器制备目的药用蛋白是目前生物技术研究的热点,但外源蛋白在乳腺组织中特异、高效表达受诸多因素影响,仍需进一步研究。本研究克隆了奶牛乳腺组织中β-防御素气管抗菌肽(TAP)基因,构建TAP基因真核表达质粒;进一步用奶牛β-乳球蛋白(BLG)基因启动子和5′端调控序列构建TAP基因乳腺特异性表达载体,并初步进行了表达。 1.利用PCR方法从奶牛基因组DNA中扩增BLG基因5′端调控序列(3 114 bp),其中包含第一、二个外显子和内含子,将其插入pMD19-T simple载体。序列分析表明,克隆的序列和原序列相似性为97%,包含多个乳腺特异性表达调控元件,可用于构建乳腺特异性表达载体,调控外源目的蛋白表达。 2.采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T simple载体中进行序列分析。结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF)195 bp,与牛TAP基因相似性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。 3.将克隆的奶牛BLG 5′端调控序列与酶切回收的真核表达质粒pEGFP-C1连接,取代原表达质粒中CMV启动子,构建pBLG-EGFP-C1通用乳腺特异性表达载体。酶切回收TAP基因序列,分别插入真核表达质粒pEGFP-C1和构建的乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-C1的多克隆位点,构建TAP基因的两种表达质粒:pEGFP-C1-TAP和pBLG-EGFP-G1-TAP。 4.运用奶牛乳汁分离培养乳腺上皮细胞和组织块法培养原代奶牛乳腺上皮细胞,将构建的乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-C1-TAP脂质体法转染原代乳腺上皮细胞,倒置荧光显微镜下观察与TAP基因融合表达的绿色荧光蛋白。72 h时观察到融合表达的绿色荧光蛋白。 5.将pEGFP-C1-TAP质粒脂质体包埋,转染到COS 7细胞中,倒置荧光显微镜下观察与TAP基因融合表达的绿色荧光蛋白,并用RT-PCR法检测COS 7细胞中奶牛TAP mRNA的表达情况。72h时观察到融合表达的绿色荧光蛋白,并在COS7细胞中检测到奶牛TAP mRNA的转录。 6.脂质体包埋pBLG-EGFP-C1-TAP和pEGFP-C1-TAP质粒,分别注射于泌乳期母兔乳腺组织中,运用RT-PCR法检测相应母兔乳腺组织中奶牛TAP mRNA的表达情况。发现TAP mRNA在兔乳腺组织中得到表达,与pEGFP-C1-TAP质粒处理母兔的乳区相比,pBLG-EGFP-C1-TAP质粒处理母兔乳区TAP表达量提高。证明构建的TAP基因乳腺特异表达质粒可在乳腺组织中表达,为进一步研制防御素的乳腺生物反应器奠定一定基础。


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