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博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达和p24片段荧光定量PCR试剂盒的研制开发

金戈  
【摘要】:背景及目的: 博尔纳病病毒(BDV)是一种嗜神经性的单股负链RNA病毒,BDV的感染宿主包括了大部分温血动物,而根据一些研究认为BDV感染也可能于人类精神疾病有关,在我国和其他国家一些地区动物、精神疾病患者和脑炎患者中均有散在BDV疑似阳性病例报导。BDV基因组含有6个开放式读码框(ORF),其中ORFⅡ编码磷蛋白(p24),磷蛋白作为抗原参与血清免疫反应可以检测判断是否有病毒感染存在。此外p24基因由于序列高度保守,并且在检测同等病毒量时其敏感性要高于核蛋白基因,故p24片段是在BDV核酸检测上的主要指标。 本研究通过原核表达出磷蛋白,并对其进行纯化和鉴定,以进一步制备抗体和开发相关免疫学检测试剂盒。另一方面在套式荧光定量PCR基础上优化适合p24扩增的PCR缓冲液,同时摸索最佳反应条件,尝试开发BDV p24片段一步法实时荧光定量PCR试剂盒,使之能达到稳定可靠而更简单方便的要求以便可以对样本进行大规模快速筛选,通过流行病学调查来了解该病毒在我国的分布及流行特征,防治将来可能出现大规模的暴发流行,此外在临床检验中可以进一步研究分析BDV和人类神经精神疾病的相关性。 方法: 1通过RT-PCR方法获得p24基因片段,将目的片段插入到pET-41a原核表达载体中构建重组质粒,转化到BL21大肠杆菌,使用IPTG诱导表达并亲和层析纯化,对诱导表达的磷蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析和鉴定。 2根据p24片段设计合成引物和探针,通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、Triton X-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的最佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找最佳的添加剂组合,最后用荧光定量PCR进行对比验证。此外在引物的退火温度、引物和探针的最佳浓度、dNTPs和Mg2+的最佳工作浓度上做出相应的优化,以求试剂盒的扩增效率和标准曲线达到满意的效果。 结果: 1成功构建pET41a-p24重组质粒,经酶切鉴定和测序后证实序列正确,SDS-PAGE分析目的蛋白表达量占菌体总蛋白30%以上,并且目的蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达85%左右,对磷蛋白进行Western-Blot鉴定可见可以与p24单克隆抗体特异性结合。 2在滴定酸上选择了效果最好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的最佳终浓度为6mmol/L。在添加剂的优化组合上,1.5mol/L甜菜碱、0.15%Triton X-100、8mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果最佳,在其与Takara的热启动PCR buffer的对比中,TBTT buffer在扩增效率和标准曲线上明显好于后者,此外退火温度、dNTPs、Mg~(2+)、引物和探针的最佳工作浓度也得以确定。 结论: 1成功诱导表达出可溶性目的蛋白,经鉴定具有正确的抗原活性,可以进一步制备抗体和建立博尔纳病病毒相关免疫学检测方法。 2成功设计了引物,并优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液,以及对反应体系进行了摸索调整,使扩增曲线和标准曲线达到了试剂盒要求。


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