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高效液相色谱法分析色氨酸代谢及其在临床诊断中的应用

甄乾娜  
【摘要】:目的: 1.建立一种高效液相色谱(HPLC)-程序波长紫外检测法同时测定血浆中色氨酸(tryptophan, Trp)及其主要代谢产物犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)和5-五羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)的浓度。 2.考察促凝剂﹑抗凝剂以及分离胶对Trp﹑Kyn和5-HT测定的干扰情况,并选择合适的抗凝剂。 3.用所建立的方法测定慢性乙肝患者(CHB)﹑抑郁症患者和维持血液透析(HD)的尿毒症患者HD前后及其各自的正常对照血浆中Trp﹑Kyn和5-HT的浓度,从而了解患者血浆中Trp的代谢状态以及HD对尿毒症患者的治疗效果。 方法: 1.以茶碱为内标,采用BDS-Hypersil-C8 (150 mm×4.6 mm, 5μm)柱分离。流动相为醋酸钠缓冲液(10 mmol/L, pH 4.5):乙腈94:6(v/v);流速为0.6 mL/min;柱温为25℃;紫外检测波长设定为0~5.5 min, 360 nm,5.6~6.0 min, 220 nm,6.1~7.0 min, 302 nm,7.1~8.0, 360 nm。进样量25μl,检测时间8.0 min。 2.分别采用促凝管,肝素、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)和加有分离胶的EDTA抗凝管收集全血样本,分离血清或血浆,用HPLC-程序波长紫外检测法测定并比较Trp﹑Kyn和5-HT的浓度。 3.用含EDTA的抗凝管分别收集15例抑郁症患者﹑20例维持HD的尿毒症患者﹑110例CHB患者以及相应的正常对照标本,1 h内分离血浆,测定血浆中Trp﹑Kyn和5-HT的浓度。 结果: 1. Kyn、5-HT、Trp和茶碱的保留时间分别为5.12、5.81、6.63和7.52 min。Kyn、5-HT和Trp的线性范围分别为:0.421μmol/L~20.2μmol/L,4.36 nmol/L~980.5 nmol/L及3.97μmol/L~400.0μmol/L,最低检测限分别为0.016μmol/L,2.03 nmol/L和0.134μmol/L。三种分析物的日内变异系数均小于4%,日间变异系数均小于5%,平均回收率在87%~113%之间。 2.采用肝素和加有分离胶的EDTA抗凝管的血浆标本其Trp﹑Kyn及5-HT含量的测定结果与EDTA抗凝管的血浆标本相比无显著差异。对于Trp,Kyn的测定,采用促凝管的血清标本与其他三种抗凝管的血浆标本均无显著差异,但血清的5-HT浓度显著高于血浆(p0.01)。 3. (1)抑郁症患者Kyn、5-HT、Trp的血浆水平均低于正常对照,且两者之间的差异具有统计学意义(p0.05)。 (2)尿毒症患者HD前血浆中Kyn,5-HT水平及Kyn/Trp比值均显著高于正常对照(p0.01),而Trp浓度显著低于正常对照(p0.01)。尿毒症患者HD后Kyn,5-HT及Kyn/Trp比值均有所降低,但5-HT水平及Kyn/Trp比值仍较正常人高,Trp水平仍低于正常人。 (3)乙肝患者Trp和5-HT水平均显著低于正常对照(p0.01),Kyn/Trp则明显高于对照组(p0.01)。 (4)乙肝患者HBV病毒复制数的对数(LogDNA)与Kyn (r=0.547; p=0.000)和Kyn/Trp (r=0.804; p=0.000)成明显的正相关,而与5-HT (r=-0.485; p=0.000)和Trp (r=-0.644; p=0.000)成明显负相关。ALT与Kyn (r=0.265; p=0.000)和Kyn/Trp (r=0.224; p=0.020)均有相关性。 (5)据病毒载量将CHB患者分成高(LogDNA6.0)﹑中(LogDNA 6.0~4.0)﹑低(LogDNA4.0)病毒组。对于Trp和Kyn/Trp,各组之间均具有显著差异(p0.01)。对于5-HT和Kyn,低病毒组和高﹑中病毒组之间有显著差异(p0.01),高﹑中病毒组间也有明显差异(p0.05)。 (6)以酶活性为80 IU/L为界将患者分为高﹑低ALT酶活性组,结果显示:高﹑低ALT酶活性组间Kyn和Kyn/Trp存在显著差异。 结论: 1.本研究建立了一种HPLC-程序波长紫外检测法同时测定血浆中Trp及其主要代谢产物Kyn和5-HT。该方法灵敏、快速、简便,适合于实验室研究和临床常规检测。 2.本研究考察了抑郁症﹑CHB及维持HD的尿毒症患者血浆中Trp的代谢,发现三种疾病均存在不同程度的Trp代谢紊乱,且HD对尿毒症患者Trp代谢有明显的纠正效果。


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