嗅鞘细胞移植治疗脊髓挫伤的实验研究

【摘要】：目的: 探索一种简单、高效、实用的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)培养方法;观察OECs对脊髓挫伤大鼠后肢运动功能的影响;检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein ,MBP)在挫伤脊髓处表达。 方法: 解剖显微镜下、无菌环境取2.5月龄的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因Sprague Dawley(SD)大鼠嗅球最外层,经酶消化法分散后将细胞接种于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。定期进行光电镜观察并摄片。培养第10d,进行NGFRp75、S100的免疫细胞化学染色鉴定OECs纯度,电镜观察其超微结构。 28只雌性成年普通SD大鼠。6只为正常组(C组),不做任何处理。另外22只应用NYUⅡ撞击机制成脊髓挫伤模型后随机分成OECs移植组(A组,16只)、DMEM组(B组,6只),随即分别移植GFP-OECs悬液、DMEM培养液,术后第ld、lw、2w、3w、4w分别进行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating scale)评分。 移植术后第3w,A、B、C组(3只/组)大鼠分别于3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,活体取出相同损伤节段相应脊髓,应用RT-PCR法检测各组大鼠脊髓损伤区BDNF的表达。 移植术后第3w,3%戊巴比妥钠(30mg/kg )腹腔注射麻醉、4%多聚甲醛灌注A组(3只)、B组(3只)、C组(3只)动物,分别从各组动物取出相同节段相应脊髓,制成石蜡切片,行BDNF免疫组织化学染色,检测各组大鼠BDNF免疫组织化学染色阳性反应产物。同时随机取3只A组大鼠灌注,于相同节段取出相应脊髓,制成冰冻切片,观察OECs植入情况。 移植术后4W,3%戊巴比妥钠(30mg/kg )腹腔注射麻醉、4%多聚甲醛灌注A组(3只)动物,取出相同节段相应移植OECs损伤脊髓,制成冰冻切片,行BDNF免疫组织化学染色。 移植术后4W,3%戊巴比妥钠(30mg/kg )腹腔注射麻醉、4%多聚甲醛灌注A组(3只)动物,取出相同节段相应脊髓,制成冰冻切片,行MBP免疫荧光组织化学染色并于激光共聚焦下拍摄。 结果: 绿色荧光嗅鞘细胞(green fluorescent protein-Olfactory ensheathing cells,GFP-OECs)在荧光显微镜下呈绿色强荧光,培养第7d,为双极样(梭形或纺锤形)、三极样和扁圆形3种典型的细胞形态,以双极梭形为主;培养第10d,细胞形态为梭形。行免疫荧光鉴定,95%以上GFP-OECs呈S100、NGFR p75双阳性。电镜下嗅鞘细胞核不规则;胞质内有丰富的粗面内质网、游离核糖体及线粒体;胞体表面有伪足样短突起。 各组大鼠在术后第ld, BBB评分均为0分,后逐渐增高。各个时期组间比较,A组BBB评分高于B组。21d后,DMEM组大鼠不能负重拖动后肢,足置于不负重位,而OECs移植组大鼠能负重拖动后肢,足置于负重位,能持续以足背负重步行,偶见足底负重步行。表明OECs移植组大鼠后肢运动功能恢复好。 移植术后3w ,脊髓石蜡切片BDNF免疫组化棕黄色阳性产物位于细胞浆,A组BDNF免疫组化染色最强,C组最弱,B组BDNF表达强于C组。A组BDNFmRNA表达最强,差异有统计学意义(P0.05)。OECs移植4W脊髓冰冻切片,行BDNF免疫组化前于荧光显微镜下观察,GFP-OECs分布于脊髓损伤空洞周围,发强烈的绿色荧光。经BDNF免疫组化染色后可见OECs周围脊髓组织棕黄色阳性反应。且在阳性反应区中,GFP-OECs所在部位呈现更强烈棕黄色BDNF免疫反应阳性产物,表明OECs分泌BDNF,且能促进其周围损伤脊髓组织表达BDNF。 OECs移植4W脊髓冰冻切片行MBP免疫荧光激光共聚焦,镜下可见强烈绿色荧光的嗅鞘细胞周围分布着免疫红色荧光MBP阳性产物。 结论: 1.本实验细胞培养方法可获得活性好、纯度高的OECs,是一种相对简便易行,且经济、高效、重复性好的OECs培养方法。 2.GFP-OECs自发的绿色荧光蛋白表达强烈、稳定持久、无副作用。GFP-OECs是研究OECs移植修复脊髓损伤作用及机制的理想工具。 3.OECs移植能促进脊髓挫伤大鼠后肢运动功能恢复。 4.OECs移植到损伤脊髓,通过增强损伤脊髓BDNF、MBP表达,发挥神经保护及促成髓鞘作用是其修复脊髓损伤的机制之一。