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PPE68/Ipr1基因的表达、鉴定及初步应用

靳志栋  
【摘要】:本课题将Ipr1 (Intracellular pathogen resistance 1,细胞内病原体抗性基因1)克隆入原核表达质粒pET32a(+),构建了原核基因表达质粒pET32a(+)-Ipr1,并成功获得Ipr1重组蛋白;将Ipr1基因与结核分枝杆菌PPE68基因分别克隆入真核表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒(pbudce4.1/ Ipr1/PPE68),体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,并在转录水平及翻译水平鉴定了Ipr1基因和PPE68基因的表达;同时构建了Ipr1基因和PPE68基因共表达穿梭质粒(pbudce4.1-Ipr1-PPE68-OriM),并将该质粒电转到BCG中,构建Ipr1/ PPE68重组BCG,为进一步研究Ipr1/PPE68重组BCG对结核分枝杆菌感染的免疫保护作用打下基础。 第一部分Ipr1基因原核表达质粒的构建及鉴定 目的:构建Ipr1基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定。 方法: PCR扩增质粒PMD19-T simple-Ipr1中的目的基因Ipr1,将目的基因Ipr1克隆入原核质粒pET32a(+),构建原核表达质粒pET32a(+)-Ipr1。将pET32a(+)-Ipr1转化表达菌株BL21, IPTG诱导目的基因的表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况。 结果:原核表达质粒pET32a(+)-Ipr1经酶切测序鉴定正确。pET32a(+)-Ipr1在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导成功表达出Ipr1重组蛋白。 结论:成功构建了含Ipr1基因的原核表达质粒pET32a(+)-Ipr1,并成功获得Ipr1重组蛋白。为Ipr1重组BCG的原核表达打下基础。 第二部分PPE68/Ipr1真核共表达质粒的构建及鉴定 目的:构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因的真核共表达质粒,观察两种基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的共表达。 方法:将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1。体外转入小鼠巨噬细胞株RAW264.7, RT-PCR、Western blotting分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因和Ipr1基因的表达。 结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与Genbank注录的PPE68和Ipr1基因序列一致。重组真核表达质粒pBud68-Ipr1瞬时转入小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用RT-PCR、Western-blotting法在转录水平及翻译水平鉴定发现,PPE68和Ipr1基因获得成功表达,PPE68和Ipr1基因编码产物分子量分别大约在37kD和50kD。 结论:成功构建了PPE68和Ipr1真核共表达质粒pBud68- Ipr1,该重组质粒转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,在转录及翻译水平检测到PPE68基因和Ipr1基因表达。PPE68/Ipr1共表达质粒的构建,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础。 第三部分PPE68/Ipr1重组BCG的构建及鉴定 目的:构建PPE68/Ipr1重组BCG。 方法:分枝杆菌复制子OriM基因片段(1896)亚克隆入已构建好的穿梭质粒pBudCE4.1-Ipr1-PPE68的NheI位点,形成穿梭质粒pBudCE4.1- Ipr1-PPE68-OriM,然后通过酶切、PCR进行鉴定。将此重组质粒电转入BCG中,构建Ipr1/ PPE68重组BCG。用PCR方法进行鉴定。 结果: pBudCE4.1-Ipr1-PPE68-OriM真核穿梭质粒经酶切和测序鉴定正确,菌落PCR成功扩增出IPR1和PPE68两个片段。 结论:成功构建真核共表达穿梭质粒pBudCE4.1- Ipr1-PPE68-OriM,成功构建Ipr1/PPE68重组BCG,为进一步研究Ipr1/PPE68重组BCG对结核分枝杆菌感染的免疫保护作用鉴定了基础。


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