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Notch基因过表达对K562细胞增殖影响及相关机制研究

杨春秀  
【摘要】:背景现有研究证实,Notch信号与造血系统的稳定密切相关,可维持造血干细胞(HSC)未分化状态,并随HSC分化而下调~【1】。Notch信号活化在不同细胞环境中可能具有双重作用。Notch2受体是Notch信号家族的重要成员,在胚胎发育过程中具有重要调控作用。有研究显示,Notch2表达异常与肿瘤发生密切相关,其表达为边缘区B细胞发育所必须~【2】,与B细胞系慢性淋巴细胞白血病CD23过度表达有关~【3】,高表达活化型Notch2可引发T淋巴细胞性白血病。但也有研究提示Notch2可能是一个新的肿瘤抑制因子~【4】,是体内抗癌抗菌素发挥作用所必需~【5】。关于其在慢性粒细胞白血病发生中的作用,尚未见相关文献报道。 目的 本课题选择慢性粒细胞白血病细胞株K562为研究对象: 1.探讨外源性Notch2基因转染入K562细胞后的表达情况; 2.Notch2过表达对K562细胞增殖的影响; 3.Notch2过表达对细胞周期的影响; 4.Notch2过表达对K562细胞增殖影响的可能机制。 方法 实验分为转染组和未转染组,两组分别培养24h、48h。 1.用脂质体将质粒pcDNA3.1-ICN2转染入K562细胞; 2.分别用RT-PCR法及Western-blot法检测转染质粒后24h、48h Notch2 mRNA及蛋白表达; 3. RT-PCR法检测转染质粒后24h,48h Notch信号下游靶基因Hes1、Hey1 mRNA的表达,以及凋亡相关因子numb、Bcl-2、NF-κB和TGF-β1 mRNA的表达; 4.倒置相差显微镜下观察K562细胞形态学变化,MTT比色法检测细胞增殖情况; 5.流式细胞仪检测细胞周期分布。 结果 1.扩增质粒进行PCR后,于387bp处可见清晰条带; 2.于转染质粒后24h、48h,Notch2 mRNA及蛋白表达均较未转染组明显增强; 3.Notch信号通路下游靶基因Hes1、Hey1表达较未转染组明显增强; 4.转染组K562数量减少,直径和体积均变小,生长显著受抑(P0.001); 5.转染后48h K562细胞G1期细胞增多(P0.005),S期细胞减少(P0.001); 6. Numb mRNA表达无明显变化,Bcl-2表达下调,NF-κB、TGF-β1表达上调。 结论 1.通过脂质体转染法将外源性Notch2基因胞内段导入K562细胞, K562细胞Notch2 mRNA及蛋白的表达均明显增加,Notch通路下游靶基因Hes1、Hey1表达增加,表明K562细胞中Notch信号通路被成功激活; 2.Notch通路激活后,K562细胞增殖受抑,细胞体积变小,胞膜透亮度下降,细胞阻滞于G1期; 3.凋亡促进因子TGF-β1、NF-κB表达上调,凋亡抑制因子Bcl-2表达下调。 4.本研究结果提示:外源性Notch2基因过表达可阻滞细胞于G1期,抑制其增殖,其机制可能是通过上调TGF-β1、NF-κB表达及下调Bcl-2表达而实现。


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