Visfatin基因表达抑制对细胞糖脂代谢的影响

【摘要】：第一部分小鼠visfatin-shRNA表达载体构建和筛选 目的:构建小鼠内脏脂肪素visfatin-shRNA表达载体。 方法:设计并合成3条针对小鼠visfatin基因的shRNA序列,分别插入载体pGenesil-1.2的mU6启动子下游,构建pGenesil-visfatin1,2和3,分别转染小鼠Hepa1-6细胞,运用实时荧光定量PCR方法筛选出抑制效果最佳的pGenesil-visfatin重组质粒,并在小鼠3T3-L1成熟脂肪细胞中验证质粒有效性。 结果:成功构建3条pGenesil-visfatin重组质粒。转染小鼠Hepa1-6细胞后,visfatin mRNA的抑制率分别为:44.9%,59.4%,71.9%(P均0.001),其中转染72小时后pGenesil-visfatin3对visfatin的抑制效果最佳。同时,经实验验证pGenesil-visfatin3使脂肪细胞visfatin mRNA表达降低约70.5%(P0.001)。 结论:成功构建visfatin-shRNA表达载体,并筛选出抑制效果最佳的pGenesil-visfatin质粒。 第二部分Visfatin基因表达下调对小鼠脂肪细胞及肝细胞糖脂代谢的影响 目的:建立visfatin基因表达下调的细胞模型,并探讨visfatin基因抑制对脂肪细胞及肝细胞糖脂代谢的影响。 方法:分别将已筛选并具最佳抑制率的pGenesil-visfatin质粒转染小鼠脂肪细胞及肝细胞,用Western blot法检测重组质粒对两种细胞visfatin蛋白表达的影响,采用实时荧光定量PCR检测细胞糖脂代谢相关基因mRNA水平的变化,并用油红O染色法对脂肪细胞内甘油三酯含量进行半定量分析。 结果:pGenesil-visfatin能有效抑制小鼠脂肪细胞和肝细胞visfatin蛋白表达。在3T3-L1脂肪细胞中,转染pGenesil-visfatin后,脂代谢相关基因PPARα/γ,HSL,ATGL,ap2,SREBP1,FAS,ACC mRNA表达均下降(其中PPARγ与ACC P0.05,余P0.001),同时脂肪细胞TG含量降低,但无统计学差异;糖代谢相关基因IRS1 mRNA表达下降(P0.001),但GLUT1则显著升高(P0.001);细胞因子leptin,FGF21 mRNA的表达也下降(P均0.001);在肝细胞中,脂代谢相关基因如PPARα,SREBP1,FAS以及SREBP2,HMGCR,LDLr mRNA表达显著降低(P0.001),而HSL,ATGL与ACC变化不具有统计学意义(P0.05);糖代谢相关基因GLUT1与PEPCK表达增加(分别P0.001和P0.01),而IRS1表达降低(P0.05);细胞因子FGF21 mRNA表达下降(P0.001)。 结论:Visfatin基因表达抑制对细胞糖、脂质代谢具有调节作用,并能影响脂肪细胞因子表达。