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TGF-β3基因转染MSCs复合壳聚糖的组织工程支架构建的实验研究

吴清华  
【摘要】:第一部分:转化细胞生长因子β_3(TGF-β_3)基因重组腺病毒载体的构建 目的将含转化细胞生长因子β_3(Transforming Growth Factor beta3, TGF-β_3)基因的质粒克隆至腺病毒质粒载体中并导入包装细胞,产生表达目的基因的重组腺病毒。 方法含有TGF-β_3的质粒经酶切、分离、纯化并采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质pShuttle-EGFP中,获得pShuttle-EGFP-TGFβ_3,与pAdxsi (腺病毒骨架质粒)转入细菌,得到TGF-β_3重组腺病毒质粒,用脂质体介导入HEK 293细胞,产生表达目的基因的重组腺病毒载体,用倍比稀释方法测定重组腺病毒载体滴度。 结果⑴TGF-β_3基因克隆进入腺病毒质粒载体中形成重组腺病毒质粒pAdxsi-EGFP-TGFβ_3 ;⑵重组腺病毒质粒pAdxsi-EGFP-TGFβ_3导入包装细胞HEK 293中形成能表达TGF-β_3的重组腺病毒Ad-TGF-β_3;⑶倍比稀释法测定获得具有高滴度重组腺病毒Ad-TGF-β_3。 结论TGF-β_3基因克隆至重组腺病毒中,成功构建TGF-β_3基因重组腺病毒载体,为进一步研究TGF-β_3基因转染骨髓间充质干细胞复合壳聚糖支架打下了良好的基础。 第二部分TGF-β_3基因重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞(MSCs)复合至壳聚糖支架的研究 目的⑴探讨壳聚糖支架的制备方法。⑵将目的基因TGF-β_3转染骨髓间充质干细胞(MSCs)复合至壳聚糖支架观察细胞的生长情况及目的基因的表达。 方法⑴利用冷冻干燥法制备壳聚糖支架。⑵密度梯度+贴壁法分离培养MSCs,将TGF-β_3转染MSCs荧光显微镜观察TGF-β_3转染MSCs情况Western-Blot检测TGF-β_3基因转染MSCs的蛋白表达情况。⑶TGF-β_3转染MSCs复合至壳聚糖支架,分别用MTT法和扫描电镜法观察细胞的生长粘附情况。 结果⑴2%(w/w)的壳聚糖溶液使用冷冻干燥法制得白色海绵状壳聚糖支架。⑵分离培养的MSCs纯度高,形态均匀,TGF-β_3转染MSCs转染效率高,Ad-TGF-β_3转染MSCs后对细胞生长增殖无影响,Western-Blot可见转染TGF-β_3的MSCs有阳性条带出现。⑶Ad-TGF-β_3转染MSCs复合至壳聚糖支架MSCs细胞生长粘附良好,Ad-TGF-β_3转染MSCs对细胞在壳聚糖支架上的生长增殖无影响,Ad-TGF-β_3转染MSCs复合至壳聚糖支架组较未复合壳聚糖支架组细胞生长增殖活性更好。 结论MSCs在壳聚糖支架上生长粘附良好,构建的目的基因TGF-β_3转染至骨髓间充质干细胞(MSCs)复合壳聚糖支架是理想的组织工程再生修复的载体。


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