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齐墩果酸诱导A549细胞凋亡蛋白质组差异表达分析及细胞内外药物含量测定

朱链链  
【摘要】:目的:齐墩果酸在临床上被广泛用于治疗肝炎,近年的研究发现其还有免疫双向调解作用、抗炎抗病毒及抗癌活性等,疗效甚好,但其作用机制尚不明确。本研究采用MTT法,流式细胞法等证实OA对A549细胞具有增殖抑制作用。进一步用HPLC法测定细胞内外OA的含量,考察相同药物浓度与A549不同的作用时间和不同药物浓度作用相同时间后细胞内外的OA含量变化,以研究OA在A549细胞内的动态作用。再结合蛋白质组学的方法对OA诱导人肺癌细胞A549做比较蛋白质组学分析,监测药物在作用过程中,人肺癌细胞A549蛋白质的变化,以期能从分子水平寻找出可能介导OA作用的靶点、生物分子,推测OA的可能作用机制,为该药在临床上的应用提供理论和实验数据。 方法:1、建立了OA对A549细胞的增殖凋亡的研究模型。培养A549细胞,并用MTT法观察了OA对A549细胞的生长抑制效应,流式细胞仪检测药物作用后细胞凋亡的情况,用DAPI染色法观察了药物作用前后细胞的形态学变化和荧光强度的变化。 2、建立了细胞内外OA的HPLC定量研究法。细胞经药物作用后分别收集细胞内外液,然后通过HPLC来进行定量分析。HPLC分析色谱条件是:色谱柱为Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm, 5μm);流动相为甲醇-水(pH 3.38)=90:10(V/V);流速为1.0 ml/min;柱温是30℃;检测波长为210 nm;进样量20μl。 3、分别提取空白细胞和OA作用后的细胞的总蛋白质,采用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离蛋白质,得到的凝胶用硝酸银染色,PDQuest软件分析识别差异表达蛋白质。胶内酶切差异蛋白点,用基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析酶切的蛋白点,得到的肽质量指纹图谱(PMF)在Mascot软件的数据库中进行查询验证。 结果:1、通过MTT方法证实了在10-200μg/ml的范围内,OA对A549细胞的增殖抑制作用明显,并且在200μg/ml时能达到80%的抑制率,呈时间和浓度依赖性关系,24、48、72h的IC50值为109.45、80.08、78.21μg/ml。通过DAPI染色后观察细胞核的形态变化,可以观察到OA作用24h以后,A549的细胞核出现形态异常,在小剂量80μg/ml时细胞染色质固缩,形成很多颗粒物质,或者细胞核破裂形成碎片,荧光强度增加,细胞凋亡开始发生,高浓度(200μg/ml)时伴有明显的细胞凋亡现象。流式细胞仪检测结果发现OA在80、120、200μg/ml时对A549细胞的增殖抑制作用与MTT实验结果相符,各组总凋亡率(n=3, x±s)(%)分别为:16.37±2.17,40.97±2.72,86.14±1.43,与对照组比较有统计学意义(p0.05)。 2、在上述色谱条件下细胞内液中OA在1.02~20.4μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9996),平均回收率为97.57%,日内精密度的RSD分别为3.03%,2.56%,1.99% ,日间精密度的RSD分别为2.42%,1.79%,2.59%;细胞外液中OA在5.1~81.6μg/ml范围内线性关系良好(r = 0.9998),平均回收率为97.37%,日内精密度的RSD为0.63%,1.99%,2.36%,日间精密度的RSD为3.52%,1.19%,1.21%,表明精密度良好。 3、通过双向电泳后得到的凝胶图经PDQuest8.0软件分析后,检测到的蛋白点约有1000个,选取其中二倍以上有显著性差异的蛋白点酶解后进行MALDI-TOF-MS分析,经数据库查询后,鉴定出4个有统计学意义的蛋白点(p﹤0.05),其中下调的蛋白有TPx-1、Actin和BTF3,上调的蛋白有Hsp27。 结论:通过MTT实验,DAPI染色实验和流式细胞术证明了OA对A549细胞有增殖抑制作用,并且通过分析细胞内外药物浓度的变化初步探讨了OA在细胞内的动态机制,再经过质谱分析和生物信息学检索在空白细胞组和药物处理组的2-DE图谱中表达差异的蛋白质斑点,初步鉴定出4种蛋白质,提示这些蛋白可能与OA的抗肿瘤作用机制相关。


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