结核分枝杆菌PPE68蛋白的表达及初步应用

【摘要】：目的: 构建结核分枝杆菌PPE68基因原核表达质粒和真核表达质粒载体,分别在大肠杆菌BL21和小鼠巨噬细胞株RAW264.7中观察PPE68基因表达。并将在大肠杆菌BL21中表达的PPE68蛋白,用亲和层析法分离纯化后,皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,制备兔抗rPPE68多克隆抗体,为进一步探讨PPE68蛋白的功能及PPE68重组BCG的构建打下基础。 方法: 1以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)/PPE68,热休克法转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。 2将结核分枝杆菌PPE68基因克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中,构建真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68。以真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western-blot法分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因的表达。 3以纯化后重组PPE68蛋白为抗原,与弗氏不完全佐剂等体积混合,采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,于第3次免疫后的第7天采血。用凝集实验与Western-blot检测抗血清的特异性,并用双向免疫扩散法测定抗血清效价。 结果: 1重组原核表达质粒pET32a(+)/PPE68经双酶切鉴定,测序结果与Genbank注录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57 000,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。 2重组真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68经双酶切所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与Genbank注录的PPE68基因序列一致。重组质粒瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用RT-PCR及Western-blot法分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因的表达。 3纯化的重组rPPE68蛋白免疫新西兰大白兔后,凝集反应与Western-blot证实了抗血清的特异性,双向免疫扩散法测得血清效价为1:16。 结论: 1成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET32a(+)-PPE68,并获得了较高纯度的重组蛋白。 2成功构建了PPE68基因的重组真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68,并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中得到了成功表达。成功将PPE68原核基因在真核系统表达,为PPE68重组BCG在活体内表达打下基础。 3成功制备了特异性兔抗PPE68蛋白多克隆抗体,为PPE蛋白的进一步应用打下基础。