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Twist-2在Kupffer细胞内毒素耐受形成机制的实验研究

游海波  
【摘要】:脓毒症是各种严重创伤、感染、缺血再灌注损伤及外科大手术常见的并发症,至今在临床上仍缺乏有效的治疗手段,由严重脓毒症和脓毒症性休克导致的病死率高达30%左右。脓毒症具有患病率高、死亡率高、治疗费用高的“三高”现象,临床上脓毒症大多数由革兰氏阴性(G-)细菌感染所致。内毒素(Endotoxin)又称脂多糖(lipoplysacchride, LPS)是G-细菌细胞壁上的主要成分和主要的致病成分,其具有广泛的生物活性,通过引起炎症细胞释放TNF-α等大量炎症介质,导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)及多器官功能障碍。 内毒素耐受(endotoxin tolerance,ET)是指预先以小剂量LPS或其同系物刺激动物或单核-巨噬细胞系统(Mononuclear phagacytic system,MPS)随后再用致死剂量的LPS攻击时,表现为对LPS的低反应性,以保护机体免受LPS致死性毒性反应的现象,称内毒素耐受。内毒素耐受被认为是生物在长期进化过程中形成的一种负反馈调节机制,是一种主动性适应性应答,总体来说内毒素耐受时的细胞因子低表达对机体的影响是积极的。目前,关于内毒素耐受及形成机制仍未完全阐明。 NF-κB是一个多功能核转录因子,在调控促炎症基因的合成和释放中起决定性作用,其过度活化并启动相关靶基因转录,可产生和释放大量炎性介质,从而引起“介质病”。在基础情况下,NF-κB二聚体被NF-κB抑制蛋白(inhibitors of NF-κB,IκB)隐没于细胞质中。因此,NF-κB活化的前提条件是IκB的降解或去除NF-κB母核的抑制区域。激活的NF-κB复合物转入细胞核内,与靶基因启动子结合后行使其转录调节功能。目前大量的研究证据表明:细胞中存在着NF-κB激活的负性调节通路,即在NF-κB激活的同时,也进行着NF-κB负性调节因子的的合成及再合成。该负性调节通路的存在能够限制和阻断前炎症因子诱导的NF-κB的活性,以限制炎症性损伤是至关重要的。 最近研究发现,扭蛋白Twist-2是核转录因子NF-κB的负性调节的重要相关蛋白,它在参与负性NF-κB调节通路及减缓炎症的应答中起到重要的作用,从而有可能参与内毒素耐受的形成机制。本研究即通过内毒素预处理建立内毒素耐受小鼠模型及体外Kupffer细胞模型,观察在内毒毒耐受状态下机体及细胞中Twist-2表达的变化,初步确定Twist-2与内毒素耐受的关系;进而采用特异性RNA干扰技术在体外沉寂Twist-2的基因表达,观察Kupffer细胞内毒素耐受性的改变;由此阐明Twist-2在内毒素耐受形成中的作用及机制,从而为脓毒症的临床治疗提供新的干预靶点和手段。第一部分Twist-2在内毒素耐受小鼠肝组织中表达变化及意义的研究 目的建立内毒素耐受小鼠模型,观察内毒素耐受小鼠接受大剂量LPS刺激前后Twist-2在肝组织中的表达变化情况,从机体水平初步探讨Twist-2与内毒素耐受之间的关系。 方法通过对实验动物处理方式的不同,随机分为内毒素非耐受组(NETT)和耐受组(ETT)。比较两组实验动物的一般情况;光镜观察肝组织病理学改变;电镜观察肝脏细胞超微结构改变;转录因子分析试剂盒检测NF-κB活性;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血浆中的TNF-α水平;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织TNF-α及Twist-2的mRNA表达水平。 结果(1)成功建立了内毒素耐受小鼠模型;(2) EET组小鼠各时相点血浆TNF-α含量、肝组织中TNF-α表达明显减弱、肝组织中NF-κB活性显著降低(P0.05);(3) NETT组在LPS刺激24h后才能在肝组织中检测到Twist-2的mRNA表达,而ETT组肝组织中Twist-2 mRNA表达在0h时已能检测,并在LPS刺激后迅速上调,于6h时达高峰,24h时其表达强度仍为非耐受组2.5倍。 结论LPS预处理能成功诱导小鼠内毒素耐受;肝组织中Twist-2高表达表达及Kupffer细胞活化受到抑制可能与内毒素耐受的形成有关。第二部分Twist-2在内毒素耐受Kupffer细胞中的表达及意义 目的观察内毒素耐受时Twist-2在kupffer细胞中表达变化情况,并探讨其在Kupffer细胞内毒素耐受中的作用及意义。 方法通过分离培养kupffer细胞,根据处理方式的不同分为非耐受组(NETT)和耐受组(ETT)。分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测kupffer细胞中Twist-2;TNF-αmRNA表达水平;蛋白印迹法(Western Blotting)检测Twist-2蛋白表达情况;以及Trans AM NF-κB Kit检测kupffer细胞内核转录因子(NF-κB)的相对活性;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中TNF-α的水平。 结果(1)成功诱导内毒素耐受Kupffer细胞模型;(2)内毒素非耐受组的NF-κB相对活性、TNF-α含量和表达均较耐受组明显升高(P0.05),(3) RT-PCR和Western blotting分析显示:NETT组细胞在LPS刺激24h后才能检测出Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白的表达,而ETT组细胞在LPS刺激前已可检测到Twist-2的基因表达,且该表达随LPS刺激的持续而维持在较高水平。 结论内毒素耐受状态下,Twist-2基因转录和翻译水平明显上调,而kupffer细胞的活性受到明显抑制,但未完全丧失,提示Twist-2具有负性调控KCs的活性的作用,在内毒素耐受的形成中起重要作用,但并非内毒素耐受的唯一机制,可能还有其它机制在内毒素耐受的形成中发挥作用。第三部分Twist-2特异性RNA干扰对Kupffer细胞内毒素耐受性的影响 目的应用RNA干扰技术(RNAi)沉寂Kupffer细胞Twist-2基因表达,观察细胞内毒素耐受性的改变,探讨Twist-2在内毒素耐受形成中的作用。 方法应用Twist-2特异性shRNA质粒,转染Kupffer细胞,以载体pGenesil-1转染为阴性对照,分为pTwist-2-shRNA转染组和pGenesil-1组,两组先经10ng/ml LPS预处理后,再用100ng/ml LPS进行孵育;用ELISA检测培养液中的TNF-α水平;RT-PCR检测细胞中的Twist-2 mRNA表达;用TransAM NF-κB Kit检测细胞中NF-κB活性,Western blotting检测其对Twist-2蛋白表达。 结果(1) pGenesil-1载体转染对Twist-2 mRNA表达无明显抑制作用,可作为阴性对照。(2) pGenesil-1组中Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白水平明显高于pTwist-2-shRNA转染组,而pGenesil-1组细胞培养液中TNF-α水平、NF-κB活性明显低于pTwist-2-shRNA转染组,各项指标比较均有显著性差异。 结论RNA干扰抑制Twist-2基因表达后,Kupffer细胞的内毒素耐受性明显减弱,表明Twist-2表达在内毒素耐受的形成机制中发挥着重要的作用。


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