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内皮素-1对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响及其机制研究

冉迎春  
【摘要】:第一部分早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化及原代培养 目的 探讨早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的分离、纯化和培养的方法,为研究内皮素-1(ET-1)干预对高氧暴露AECⅡ的影响及其作用机制提供细胞模型。 方法 水合氯醛麻醉孕19天Sprague-Dawley(SD)大鼠,剖宫产取出胎鼠,分离肺组织,采用胰酶结合胶原酶的方法消化肺组织细胞,制成细胞悬液,用差速离心和反复贴壁的方法纯化AECⅡ,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞。台盼蓝染色检测细胞活力,改良巴氏染色检测细胞纯度,透射电镜鉴定细胞,倒置相差显微镜观察细胞生长情况。 结果 每只孕鼠可获得19天胎龄的早产鼠数量为8~11只(95% CI),每只早产鼠可获得AECⅡ细胞数为(7.7±0.9)×10~6,细胞的活力为(95.5±1.6)%,纯度为(95.0±1.5)%。透射电镜观察细胞表面有短小的微绒毛,胞质内有特征性的板层小体。倒置相差显微镜下观察AECⅡ原代培养12~18h左右已经贴壁生长,培养24~48h细胞处于对数生长期,72h时细胞形态发生改变,变得扁平,贴壁细胞减少。 结论 采用胰酶联合胶原酶的消化方法,通过差速离心和反复贴壁可获得高产量、高纯度、高活力的早产鼠AECⅡ,能满足实验的需要。AECⅡ体外培养24~48h时,细胞生长良好,此时适和做体外研究。 第二部分内皮素-1对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响 目的 建立早产鼠AECⅡ的氧化损伤模型,观察内皮素-1和其受体拮抗剂对高氧暴露早产鼠AECⅡ的影响。 方法 1、将原代分离纯化的早产鼠AECⅡ接种至培养板,实验随机分为空气组、高氧组和高氧组+ET-1组(ET-1浓度为10~-10 mol/L~10~-6 mol/L)。高氧组和高氧+ET-1组置于氧体积分数为95%的氧仓中后,与空气组一同放入培养箱中,24h后MTT法检测各组细胞的存活情况。 2、AECⅡ接种至培养板,实验随机分为空气组、高氧组、高氧+ET-1组、高氧+ET-1+非选择性内皮素受体拮抗剂PD145065组。高氧+ET-1组加入10~-8 mol/L的ET-1;高氧+ET-1+PD145065组加入10~-8 mol/L的ET-1和10~-6 mol/L的PD145065,高氧暴露24h后,显微镜观察细胞形态变化,MTT法了解AECⅡ增殖情况,流式细胞仪检测细胞死亡率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光测定表面活性蛋白C(SP-C)的表达。 结果 用不同浓度的ET-1干预高氧暴露的AECⅡ,当ET-1浓度为10~-8 mol/L~10~-6 mol/L时,明显抑制细胞存活。我们选择10~-8 mol/L的ET-1进行下一步实验。MTT法及流式细胞术检测发现,与空气组比较,高氧组存活的细胞减少,死亡的细胞增多;加入ET-1后存活细胞进一步减少,细胞死亡率升高明显;当预先加入10~-6 mol/L PD145065后,与高氧+ET-1组比较存活细胞增多,死亡细胞减少。RT-PCR及免疫荧光检测发现高氧组SP-C相对光密度及荧光强度均较空气组降低,提示SP-C表达减少。ET-1干预后,SP-C的表达较高氧组低;预先加入拮抗剂PD145065后,SP-C的光密度和荧光强度增加。 结论 高氧暴露可抑制AECⅡ细胞增殖,促进AECⅡ细胞死亡,并使其表达SP-C的能力下降;ET-1对高氧诱导的AECⅡ损伤有促进作用,细胞死亡率进一步增加,SP-C表达下降明显;非选择性内皮素受体拮抗剂PD145065对ET-1诱导的细胞增殖抑制和死亡增加有保护作用。 第三部分内皮素-1对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用及信号机制 目的 研究ET-1及其不同受体拮抗剂干预对高氧暴露AECⅡ存活、死亡和SP-C表达的影响,明确ROS-MAPKs信号通路是否参与了高氧暴露时ET-1促AECⅡ损伤的调控。 方法 将原代分离纯化的早产鼠AECⅡ接种至培养板,实验随机分为空气组、高氧组、高氧+ET-1组(10~-8 mol/L ET-1)、高氧+ET-1+选择性内皮素受体A拮抗剂BQ123组(10~-8 mol/L ET-1和10~-6mol/L BQ123)和高氧+ET-1+选择性内皮素受体B拮抗剂BQ788组(10~-8 mol/L ET-1和10~-6 mol/L BQ788)。高氧暴露24h后,MTT检测细胞存活情况,流式细胞术检测细胞死亡率和细胞内ROS水平,蛋白质印迹法(Western Blot)检测SP-C,磷酸化ERK、JNK、p38(p-ERK、JNK、p38)和非磷酸化总的ERK、JNK、p38的表达。 结果 予ET-1干预后,高氧暴露的AECⅡ存活减少,死亡率增加,SP-C表达下降,差异有明显的统计学意义。预先加入BQ123后,存活的AECⅡ增多,细胞死亡率下降,SP-C表达升高,而BQ788对ET-1促AECⅡ损伤的作用无明显影响。与空气组相比,高氧组AECⅡ细胞内ROS、p-ERK、p-JNK和p-38水平明显升高。加入ET-1后,高氧暴露的AECⅡ细胞内ROS进一步增多,同时下调p-ERK表达,进一步上调p-JNK和p-38表达。予BQ123和BQ-788干预,BQ123能够部分抑制ET-1诱导的ROS和p-JNK、p-38水平升高,上调p-ERK表达,而BQ788对上述作用无影响。各组非磷酸化的总ERK、JNK和p38的表达无明显差异。 结论 ET-1可能通过与内皮素受体A结合,促细胞内ROS生成,同时激活JNK和p38,抑制ERK活性,参与对AECⅡ损伤的调控。选择性内皮素受体A拮抗剂对ET-1诱导的细胞损伤有保护作用。


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