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骨髓间充质干细胞对实验性肝纤维化大鼠的作用及机制探讨

周伟  
【摘要】:背景 肝纤维化是近年肝病领域的研究热点。成功逆转肝纤维化不仅意味着治愈众多的肝病患者,并可减少肝癌的发生率,具有重大的社会效益和经济效益。肝纤维化是肝脏内细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)弥漫性过度沉积性疾病,其发生机制主要是肝内ECM合成和降解失衡,表现为ECM大量沉积。过去认为肝脏损伤-肝实质炎症、坏死-肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)激活为肌成纤维细胞(Myofibroblasts, MFB)-大量ECM沉积,是肝纤维化发生机制的核心环节。过去20年中,基于HSC激活和向MFB转分化这一肝纤维化发生的“经典原理”的研究已取得长足进步。然而,许多干预因素在体外试验中抑制活化、增殖和分泌作用显著,而在体内试验中对肝纤维化的防治效果却不佳。因此,MFB可能是一种多起源的异质性细胞。尽管目前有大量关于间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)逆转肝纤维化的实验研究,但仍有一部分研究表明MSCs参与了肝纤维化的形成。因此,因此应用骨髓MSCs移植究竟能逆转肝纤维化还是促进其发展是目前亟待解决的关键问题。 目的 本研究旨在关注骨髓MSCs对实验性肝纤维化大鼠的作用。选取简单可行的体外示踪剂,建立肝纤维化大鼠模型,尾静脉移植骨髓MSCs,以明确骨髓MSCs在肝纤维化大鼠的分布及分化方向。同时,体外应用诱导剂确定骨髓MSCs与在肝纤维化大鼠体内有相同的分化方向。通过对肝组织病理形态学变化,部分肝功能指标的变化,及肝纤维化发生发展密切相关的指标进行检测,明确骨髓MSCs对实验性肝纤维化大鼠的作用。应用实时定量PCR检测骨髓MSCs移植对对实验性肝纤维化大鼠的转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)/Smads信号通路的影响,同时也为肝纤维化和肝硬化的防治提供新的思路和依据。 方法 1取大鼠股骨、胫骨骨髓,直接贴壁法分离纯化骨髓MSCs并体外传代,取P3代细胞流式细胞仪鉴定细胞表面抗原CD29、CD90、CD34、CD45 ,并进行成骨、成脂诱导, 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)体外标记骨髓MSCs,并测定标记阳性率,台盼蓝染色测定骨髓MSCs活力,MTT法检测DAPI标记对细胞增殖率的影响,筛选最适浓度进行标记,免疫细胞化学检测骨髓MSCs的Ⅰ型胶原(Type 1 collagen, Col 1),波形蛋白(Vimentin,Vim)和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达。 2建立大鼠肝纤维化模型,随机分为正常组(雄性)、模型组(雌性)、MSCs移植组(雌性),正常组给予正常饮水饮食,皮下注射100%橄榄油,每周3次,共9周,模型组和MSCs移植组以5%乙醇为唯一饮料,皮下注射40%四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCL_4)橄榄油溶液,每周3次,共9周。MSCs移植组在造模8周末给予尾静脉注射DAPI标记的雄性的骨髓MSCs 1×10_6。9周后处死全部大鼠,肝组织HE染色、VG染色确定肝组织形态学的变化,逆转录酶聚合酶链反应(Reverse transcriptase PCR,RT-PCR)检测肝组织中Y染色体基因SRY的表达,确定骨髓MSCs是否归巢到肝脏。间接免疫荧光法检测α-SMA的表达,激光共聚焦和荧光显微镜观察DAPI标记的骨髓MSCs在肝脏的分布,并观察α-SMA在肝脏的分布,并观察在同一细胞中两者是否共同表达。骨髓MSCs分别予以含TGFβ1,地塞米松(Dexamethasone,Dex)的培养液共培养,免疫细胞化学法和Real time PCR检测Col 1 ,Vim和α-SMA的表达变化。3建立肝纤维化大鼠模型,造模方法同上,随机分为正常组、模型组、MSCs移植组。MSCs移植组在造模8周末给予尾静脉注射骨髓MSCs 1×10_6。12周后处死全部大鼠,肝组织HE染色、VG染色确定肝组织形态学的变化,全自动生化仪检测部分肝功能指标,免疫组织化学法检测与肝纤维化发生发展密切相关的Col 1、Vim、α-SMA的表达变化,Real time PCR检测肝组织TGFβ1,Smad3和Smad7的表达。 结果 1骨髓MSCs表达CD29阳性率99.81%、CD90阳性率99.29%、CD34阳性率0.11%、CD45阳性率0.28%,骨髓MSCs可在不同的诱导因素作用下向成骨、成脂方向分化,DAPI以50ug/m1为最佳浓度进行标记,标记率高,对细胞增殖和活力无影响,免疫细胞化学检测骨髓MSCs表达Col 1、Vim,不表达α-SMA。 2模型组、MSCs移植组大鼠肝组织造模8周和9周后可见大鼠肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性,在门脉区有大量的胶原纤维增生,形成假小叶。RT-PCR检测在骨髓MSCs移植1周后MSCs移植组大鼠肝组织中有雄性大鼠Y染色体基因SRY的表达。DAPI标记的骨髓MSCs主要分布在MSCs移植组大鼠肝脏纤维条索中,并同时表达α-SMA。实时定量PCR检测和免疫细胞化学检测MSCs表达Col 1和Vim,予以含20ng/ml TGFβ1的培养液培养48h后Col 1和Vim表达明显增加,同时给予20ng/ml TGFβ1和地塞米松1μM共培养后,24h和48h后Col 1和Vim表达明显增加,同时48h表达较24h明显增加。MSCs不表达α-SMA,给予含20ng/ml TGFβ1培养液培养48小时后可见α-SMA表达,同时给予20ng/ml TGFβ1和地塞米松1μM共培养后,24h和48h后可见α-SMA的表达,同时48h表达较24h明显增加。 3骨髓MSCs移植对于已经形成假小叶的肝纤维化大鼠的作用,从肝组织病理形态学变化,部分肝功能指标表达的变化,与肝纤维化发生发展密切相关的Col 1、Vim、α-SMA的表达变化,移植4周后骨髓MSCs无明显改善肝纤维化的作用。这与骨髓MSCs在肝纤维化大鼠体内分化为MFB,参与了肝纤维化的形成有关,同时骨髓MSCs移植上调了肝脏TGFβ1和Smad3的表达,下调了Smad7的表达。 结论 1本研究用直接贴壁法分离培养骨髓MSCs,具有成脂和成骨多向分化能力,DAPI以50ug/m1为最佳浓度标记骨髓MSCs,骨髓MSCs表达Col 1、Vim,不表达α-SMA。 2本实验通过体内实验证明骨髓MSCs在肝纤维化大鼠体内分化为MFB,体外在TGFβ1和地塞米松诱导作用下分化为MFB。 3骨髓MSCs在肝纤维化大鼠体内主要分化为MFB,骨髓MSCs移植通过上调了肝脏TGFβ1和Smad3的表达,下调了Smad7的表达,促进了移植的骨髓MSCs归巢到受损的肝脏,因此骨髓MSCs移植无明显逆转肝纤维化的作用。


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