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整合素αVβ3在机械通气性肺损伤中的作用及机制

王彬  
【摘要】:目的机械通气是呼吸衰竭患者不可缺少的生命支持手段,也是手术患者常用的呼吸管理方法,而机械通气性肺损伤(ventilator induced lung injury, VILI)是机械通气的常见并发症,影响机械通气的治疗效果。尽管肺保护通气策略(小潮气量机械通气)能减少VILI的发生,但为了保证足够的气体交换潮气量的减少常常受到限制,因此寻求VILI有效的药物预防仍有重要意义。VILI的主要病理基础是肺泡炎症及肺泡毛细血管通透性增加,但具体机制还不清楚。因此,本研究拟观察SD大鼠VILI过程中肺泡炎症反应、整合素αVβ3、核转录因子(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性,以及人工合成RGDS肽(非特异性整合素受体阻断剂)对机械通气导致的αVβ3、NF-κB活性变化的影响,以期阐明整合素αVβ3介导的NF-κB通路在肺泡炎症中的作用。同时,建立人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular,HPMVEC)的机械牵拉模型,观察机械牵拉对HPMVEC单层通透性及整合素αVβ3活性的影响,并分析两者的关系,以期阐明整合素αVβ3在肺泡毛细血管通透性中的作用。从而最终明确整合素αVβ3在VILI中的作用及相关机制,为VILI的防治寻求新的靶点。 方法 动物实验:21只雄性SD(Sprague Dawley)成年大鼠随机分为3组(n=7):对照组(Control组),大潮气量机械通气组(H_(VT)组);RGDS肽预处理组(H_(VT)+RGDS组)。各组大鼠麻醉后气管切开插管,Control组大鼠自主呼吸4 h;H_(VT)组大鼠行机械通气,潮气量35 ml/kg,呼吸频率50次/min;H_(VT)+RGDS组在机械通气前30 min给予整合素受体阻断剂RGDS肽5 mg/kg腹腔注射,机械通气参数设定同H_(VT)组。机械通气4 h后放血处死大鼠,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage ?uid,BALF)和肺组织。BALF经离心分别收集上清和沉淀,用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)检测上清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的浓度,用BAC( bicinchoninic acid)蛋白检测试剂盒检测上清中总蛋白的浓度;BALF沉淀用于有核细胞计数,并通过细胞涂片的瑞氏染色对有核细胞进行分类。左肺组织行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肺组织病理变化;右肺组织提取总蛋白并用蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法测定整合素αVβ3、NF-κB抑制蛋白(I-κB)的表达以及其磷酸化水平。 细胞实验:购买HPMVEC细胞株进行培养传代,4~8代细胞用于实验。实验分为3组:对照组(Control组);机械牵拉组(Stretch组);ML9预处理组(Stretch+ML9组)。Control组细胞静态培养在培养箱内,不给予机械牵拉;Stretch组细胞给予机械牵拉刺激2 h;Stretch+ML9组细胞于机械牵拉前给予肌球蛋白轻链激酶抑制剂ML9预处理(50μM,2 h)。用磁扭力刺激(magnetic twisting stimulation, MTS)对单层内皮细胞实施机械牵拉。用Transwell模型及异硫氰酸荧光素标记的右旋糖苷(fluorescrin isothiocyanate marked dextran, FITC-dextran)溶液检测单层细胞通透性,右旋糖苷通过单层内皮细胞的多少代表单层细胞通透性,用光密度(optical density, OD)表示;用磁扭力细胞仪(magnetic twisting cytometry, MTC)检测细胞间拉力;用免疫荧光染色检测整合素αVβ3和肌动蛋白的分布;用Western Blot方法检测整合素αVβ3的表达。 计量资料用均数±标准差表示。采用SPSS12.0统计软件进行方差分析(ANOVA),P值小于0.05为差异有显著性。 结果 动物实验:(1)Control组大鼠无明显的病理改变,而H_(VT)组肺组织病理变化明显,包括炎症细胞浸润、肺泡水肿以及肺泡结构破坏,而H_(VT)+RGDS组的肺组织病理变化较H_(VT)组明显减轻;(2)与Control组比较,H_(VT)组支气管肺泡灌洗液中多核细胞、单核细胞数量和总蛋白浓度明显增高;与H_(VT)组比较,H_(VT)+RGDS组支气管肺泡灌洗液中多核细胞、单核细胞及总蛋白明显减少(P0.05);(3)与Control组比较,H_(VT)组支气管肺泡灌洗液中IL-6,TNF-α浓度明显增加;与H_(VT)组比较,H_(VT)+RGDS组支气管肺泡灌洗液中IL-6,TNF-α浓度明显减少(P0.05);(4)与Control组比较,H_(VT)组肺组织整合素αVβ3、I-κB磷酸化明显增加;与H_(VT)组比较,H_(VT)+RGDS组肺组织整合素αVβ3、I-κB磷酸化明显减少(P0.05)。 细胞实验:(1)与Control组比较,Stretch组的通透性明显增加(P0.05),而Stretch+ML9组通透性无明显变化;(2)Control组细胞肌动蛋白主要分布在细胞周边,而Stretch组细胞浆内可见明显的应力纤维形成,Stretch+ML9组肌动蛋白的分布与Control组相似(;3)Control组细胞整合素αVβ3均匀分布在细胞表面;而Stretch组细胞的整合素αVβ3明显簇积;Stretch+ML9组细胞整合素αVβ3的分布与Control组相似;(4)与Control组比较,Stretch组细胞间拉力明显增加(P0.05),而Stretch+ML9组无明显改变。 结论(1)整合素αVβ3活化参与VILI的炎症反应及毛细血管通透性增加;(2)整合素αVβ3介导的NF-κB活化是VILI炎症反应的机制之一;(3)整合素αVβ3簇积及应力纤维形成导致的细胞间拉力增加是VILI毛细血管通透性增加的可能机制; (4)抑制整合素活性可望成为VILI新的防治手段。


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