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Gadd45α介导的信号转导通路参与子痫前期发病的分子机制及实验研究

罗欣  
【摘要】:目的:检测胎盘组织中Gadd45α及p38 MAPK信号分子的活化情况及表达定位;测定妊娠晚期孕妇血清中sFlt-1及sEng的含量;计数妊娠晚期人胎盘微血管密度(microvessel density, MVD)。通过构建体外血管内皮细胞氧化应激损伤模型,探讨Gadd45α—p38 MAPK信号通路在子痫前期血管内皮细胞损伤中的作用,并明确其分子机制,同时探讨其用于治疗子痫前期的潜能。 方法:(1)采用Quantitative real-time PCR检测正常妊娠及子痫前期孕妇胎盘组织中Gadd45αmRNA水平;采用Western blotting检测各组胎盘组织中Gadd45α的蛋白水平以及p38 MAPK的磷酸化差异;应用免疫组化法检测Gadd45α及phospho-p38 MAPK蛋白在各组胎盘组织中的定位并计数胎盘微血管密度;ELISA检测各组孕妇血清样本中sFlt-1及可溶性sEng的含量。(2)通过构建、包装靶向人Gadd45α基因的shRNA慢病毒颗粒,敲减Gadd45α的表达;同时通过特异性的p38 MAPK抑制剂SB203580,阻断p38 MAPK信号通路,观察对缺氧/复氧损伤致HUVEC释放sFlt-1及sEng的影响;采用Western blotting检测各组细胞中Gadd45α蛋白的表达、p38 MAPK的磷酸化情况,由此验证血管内皮细胞缺氧/复氧损伤—Gadd45α↑—phospho-p38 MAPK↑—sFlt-1, sEng↑这一信号通路。(3)通过构建血管内皮细胞缺氧/复氧损伤模型,模拟缺血再灌注所诱导的氧化应激损伤,检测细胞凋亡率,氧化应激指标MDA、SOD、GSH-Px,体外迁移及管腔形成能力,观察敲减Gadd45α基因及阻断p38 MAPK信号通路对缺氧/复氧致HUVEC生物学功能损伤的影响,进一步明确前期实验证实的Gadd45α—p38 MAPK信号通路在氧化应激致子痫前期血管内皮损伤中的作用机制。 结果:(1)子痫前期组中Gadd45αmRNA表达显著高于正常对照组;免疫组化检测Gadd45α和phospho-p38 MAPK蛋白主要定位于子痫前期胎盘滋养层细胞胞浆及胞核、血管内皮细胞及少量间质细胞胞核,在正常对照组胎盘组织中,仅见滋养层细胞阳性染色;子痫前期组患者胎盘MVD显著低于正常对照组。子痫前期组患者血清sFlt-1及sEng水平均显著高于正常对照组;同时子痫前期组胎盘Gadd45α的蛋白表达水平与血清中sFlt-1、sEng的含量呈正相关。(2)缺氧/复氧处理可导致HUVEC中Gadd45α表达上调,p38 MAPK显著活化以及sFlt-1, sEng的释放增加;敲减Gadd45α的表达,可抑制p38 MAPK的活化和sFlt-1, sEng的释放;阻断p38 MAPK信号通路,对Gadd45α的表达无影响,但仍可抑制sFlt-1, sEng的释放;由此证实了血管内皮细胞缺氧/复氧损伤—Gadd45α↑—phospho-p38 MAPK↑—sFlt-1, sEng↑信号通路。(3)缺氧/复氧损伤可导致HUVEC过度凋亡,细胞内氧化应激损伤,体外迁移及管腔形成能力下降;敲减Gadd45α的表达或阻断p38 MAPK信号通路,可以有效抑制缺氧/复氧处理致HUVEC的凋亡率增加,改善SOD、GSH-Px的酶活性,同时抑制MDA的蓄积;同时提高缺氧/复氧损伤下的HUVEC的体外迁移和管腔形成能力。 结论:(1) Gadd45α—p38 MAPK参与子痫前期的发生,且与循环中升高的sFlt-1, sEng密切相关。(2)在内皮细胞中存在缺氧/复氧损伤—Gadd45α↑—phospho-p38 MAPK↑—sFlt-1, sEng↑这一级联信号通路,阐明了sFlt-1, sEng潜在的升高机制,同时为子痫前期的病因学研究提供了新的靶点。(3)靶向人Gadd45α基因治疗促血管新生以改善缺血胎盘的血供以实现胎盘血管再建;同时以p38 MAPK信号转导通路作为靶点开发新的药物,是治疗子痫前期的新思路。


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