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iTRAQ多重标记技术与系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的差异蛋白质组学研究

王林纤  
【摘要】:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及全身多个系统,复发和缓解交替出现的自身免疫性疾病。该病的病程长,结果不可预知,其发病机制尚未阐明。本研究首次采用相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)多重标记串联质谱技术,在“整体”蛋白组范围内,对SLE患者外周血单个核细胞进行高通量的“全组”蛋白直接鉴定和相对定量分析,绘制出SLE疾病特异性蛋白图谱,以获得参与SLE淋巴细胞调节通路的新的关键因子,为进一步阐明SLE的发病机制及SLE的诊断和治疗提供新的方法和依据。对在SLE疾病活动组中出现低表达的STRAP蛋白进行了Western blot验证,分析了该蛋白表达水平与SLE疾病活动的相关性。STRAP有望作为SLE疾病活动阶段的特异性标志物,为临床提供参考。 第一部分iTRAQ多重标记技术用于人外周血单个核细胞蛋白定量的重复性和准确性 目的建立并优化人外周血单个核细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)多重标记技术,为进一步研究奠定基础。方法分离人外周血单个核细胞,抽提细胞总蛋白,经胰酶消化后进行iTRAQ标记和串联质谱检测。重复试验3次,每次随机选取30个前体离子进行质谱检测。结果3次试验检测到带有iTRAQ标记报告基团的肽段分别为26、28和29个,标记效率为86.7%~96.7%,组间差异无统计学意义(P 0.05);不同蛋白的肽段相对定量比值的变异系数为7.6%~25.5%,组间差异无统计学意义(P 0.05);同一蛋白的不同肽段相对定量比值的变异系数为9.3%~19.1%,组间差异亦无统计学意义(P 0.05)。结论iTRAQ多重标记串联质谱技术可用于人外周血单个核细胞蛋白的标记,其标记效率高,重复性和准确性好,可作为研究多种自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞的定量蛋白质组学技术。 第二部分iTRAQ多重标记技术用于系统性红斑狼疮疾病的差异蛋白质组学研究 目的应用iTRAQ多重标记技术对系统性红斑狼疮(SLE)病人外周血单个核细胞中的“全组”蛋白进行鉴定和定量分析,获得SLE疾病特异性的蛋白质组差异表达图谱。方法利用基于四重相对和绝对定量的等量异位标签技术对SLE稳定期、活动期病人以及类风湿关节炎病人和健康人的外周血单个核细胞总蛋白进行标记,结合多维液相色谱分离和基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析,用肽质量指纹谱经数据库检索鉴定蛋白质,并比较这些蛋白的表达差异。结果共鉴定了四百多个蛋白质。与健康对照组相比,SLE稳定组和SLE活动组共发现两倍以上表达差异的蛋白质44个,其中上调的9个,下调的35个;与RA组相比,SLE稳定组和SLE活动组两倍以上表达差异的蛋白共有52个,其中上调的19个,下调的33个;SLE活动组与SLE稳定组相比,表达上调和下调的蛋白分别为17个和13个。结论定量蛋白质组学技术可有效地用于人外周血单个核细胞蛋白鉴定和相对定量;采用该技术获得了SLE病人外周血单个核细胞的蛋白质组差异表达图谱;深入研究这些蛋白的分子机制将有助于进一步阐明SLE的发病机理,为SLE的诊断和治疗提供新途径。 第三部分丝氨酸苏氨酸激酶受体相关蛋白在系统性红斑狼疮疾病中的差异表达分析 目的分析丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关蛋白在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中的表达水平的差异,探讨该蛋白检测在系统性红斑狼疮病情判断中的可能应用。方法用iTRAQ多重标记串联质谱技术对丝氨酸苏氨酸激酶受体相关蛋白进行鉴定和相对定量分析,随后用Western blot技术对该蛋白的表达水平进行较大样本的独立验证。结果基于质谱分析的蛋白组学结果表明,丝氨酸苏氨酸激酶受体相关蛋白在系统性红斑狼疮活动期患者外周单个核细胞中表达显著下调(与正常人的相对比值为0.2906),且该蛋白的低表达为Western blot实验进一步证实(P 0.05)。临床资料分析表明,该蛋白的表达水平与系统性红斑狼疮疾病活动指数呈负相关(r = -0.607,P 0.05)。结论丝氨酸苏氨酸激酶受体相关蛋白可能参与SLE的发病,该蛋白有望作为系统性红斑狼疮活动阶段的特异性标志物,为临床提供参考。


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