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RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

李红彦  
【摘要】:目的构建融合表达载体pcDNA3.1–RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin, ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells, HUVEC)增殖及迁移能的影响。 方法用RT-PCR方法扩增了RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1–,构建融合表达载体pcDNA3.1–RI,在脂质体介导下转染人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平,Western blot检测RI、ANG及影响内皮细胞迁移能力重要的2个蛋白MMP-2、MMP-9的表达水平,;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期的分布。 结果真核表达质粒构建成功;实验组pcDNA3.1-RI细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转pcDNA3.1–空载体组和未转染质粒组)比较,均呈显著性增加(P0.05),转染RI基因的细胞ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P0.05);MMP-2、MMP-9基因的蛋白表达水平降低(P0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1–RI质粒到HUVEC细胞后细胞的增殖活力明显降低(P0.05),G0~G1期比例明显增加,S期减少。 结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。


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