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JAZF1基因抑制对糖脂代谢及相关信号通路的影响

杜林  
【摘要】:目的:构建小鼠JAZF1-shRNA表达载体并构建JAZF1基因下调细胞模型,为下一步研究JAZF1抑制条件下的糖脂代谢提供实验基础。 方法:针对小鼠JAZF1基因序列设计合成3条shRNA序列,载体为pGenesil-1.2,启动子选择为mU6,构建pGenesil-JAZF1抑制质粒1,2,3。转染小鼠Hepa1-6细胞,运用荧光定量PCR技术筛选最佳抑制质粒,随后转染小鼠3T3-l1细胞,对抑制效率进行验证。 结果:成功构建了3条pGenesil-JAZF1重组质粒,其中pGenesil-JAZF1-3号抑制质粒筛选为最佳抑制片段。成功构建JAZF1基因表达下调细胞膜型,在hepa1-6细胞中抑制率为78-84%;在转染诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,其表达显著低于空白对照约57.3%。 结论:成功构建JAZF1-shRNA表达载体,筛选出抑制效果最佳的质粒,并构建JAZF1基因下调细胞模型。 目的:在JAZF1基因表达下调的细胞模型基础上,探讨JAZF1基因抑制对脂肪细胞及肝细胞糖脂代谢的影响。 方法:小鼠脂肪细胞及肝细胞分别转染最佳抑制效率的pGenesil-JAZF1-3号质粒,应用免疫荧光法检测细胞糖代谢相关蛋白的表达,Western blot法及细胞免疫荧光法检测两种细胞糖脂代谢相关蛋白表达的影响。细胞糖代谢指标的mRNA水平变化采用实时荧光PCR技术检测,脂肪细胞甘油三酯含量变化用油红O染色半定量检测,运用氢三放射示踪法检测脂肪细胞糖摄取率。 结果:在肝细胞中,糖代谢相关基因GLUT1和GLUT4mRNA表达下降(P0.05),GLUT1蛋白表达升高但无统计学差异,G-6-Pase蛋白表达降低但无统计学差异,PEPCK蛋白表达水平降低(P0.05);脂代谢相关基因HSL蛋白表达降低,PPAR-γ蛋白表达升高,但无统计学差异。在脂肪细胞中,糖代谢相关基因GLUT1和GLUT4mRNA表达下降(P0.05),GLUT1和GLUT4蛋白表达升高但无统计学差异;脂代谢相关基因HSL表达降低(P0.05),PPAR-γ表达升高(P0.05);细胞因子Visfatin和脂联素蛋白表达均下降(P0.05);胆固醇代谢相关基因Insig-2蛋白表达下降(P0.05)。 结论: JAZF1基因抑制可减少基础糖转运,增加脂质与胆固醇合成,减少脂质分解并减少相关脂肪细胞因子的表达。 目的:通过对糖脂代谢相关信号通路变化的研究,进一步明确JAZF1基因抑制对细胞糖脂代谢的影响机制。 方法:运用Western blot技术检测两种细胞糖脂代谢相关信号通路蛋白表达的影响。 结果:在肝细胞中,JAZF1抑制条件下的AKT和AMPK的磷酸化差异不明显,无统计学意义。在脂肪细胞中,AKT/PKA/HSL脂代谢通路和AMPK/TORC2糖代谢通路均被抑制,有显著的统计学差异(P0.01)。 结论:JAZF1基因抑制是糖尿病糖脂代谢中信号通路的重要影响因素,其作用加重了糖尿病的风险。JAZF1基因可能是促进糖脂代谢信号通路发生磷酸化的重要因子。


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