JAZF1基因抑制对糖脂代谢及相关信号通路的影响

【摘要】：目的：构建小鼠JAZF1-shRNA表达载体并构建JAZF1基因下调细胞模型，为下一步研究JAZF1抑制条件下的糖脂代谢提供实验基础。 方法：针对小鼠JAZF1基因序列设计合成3条shRNA序列，载体为pGenesil-1.2，启动子选择为mU6,构建pGenesil-JAZF1抑制质粒1,2,3。转染小鼠Hepa1-6细胞，运用荧光定量PCR技术筛选最佳抑制质粒，随后转染小鼠3T3-l1细胞，对抑制效率进行验证。 结果：成功构建了3条pGenesil-JAZF1重组质粒，其中pGenesil-JAZF1-3号抑制质粒筛选为最佳抑制片段。成功构建JAZF1基因表达下调细胞膜型，在hepa1-6细胞中抑制率为78-84%；在转染诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，其表达显著低于空白对照约57.3%。 结论：成功构建JAZF1-shRNA表达载体，筛选出抑制效果最佳的质粒，并构建JAZF1基因下调细胞模型。 目的：在JAZF1基因表达下调的细胞模型基础上，探讨JAZF1基因抑制对脂肪细胞及肝细胞糖脂代谢的影响。 方法：小鼠脂肪细胞及肝细胞分别转染最佳抑制效率的pGenesil-JAZF1-3号质粒，应用免疫荧光法检测细胞糖代谢相关蛋白的表达，Western blot法及细胞免疫荧光法检测两种细胞糖脂代谢相关蛋白表达的影响。细胞糖代谢指标的mRNA水平变化采用实时荧光PCR技术检测，脂肪细胞甘油三酯含量变化用油红O染色半定量检测，运用氢三放射示踪法检测脂肪细胞糖摄取率。 结果：在肝细胞中，糖代谢相关基因GLUT1和GLUT4mRNA表达下降（P0.05），GLUT1蛋白表达升高但无统计学差异，G-6-Pase蛋白表达降低但无统计学差异，PEPCK蛋白表达水平降低（P0.05）；脂代谢相关基因HSL蛋白表达降低，PPAR-γ蛋白表达升高，但无统计学差异。在脂肪细胞中，糖代谢相关基因GLUT1和GLUT4mRNA表达下降（P0.05），GLUT1和GLUT4蛋白表达升高但无统计学差异；脂代谢相关基因HSL表达降低(P0.05），PPAR-γ表达升高(P0.05）；细胞因子Visfatin和脂联素蛋白表达均下降（P0.05）；胆固醇代谢相关基因Insig-2蛋白表达下降（P0.05）。 结论： JAZF1基因抑制可减少基础糖转运，增加脂质与胆固醇合成，减少脂质分解并减少相关脂肪细胞因子的表达。 目的：通过对糖脂代谢相关信号通路变化的研究，进一步明确JAZF1基因抑制对细胞糖脂代谢的影响机制。 方法：运用Western blot技术检测两种细胞糖脂代谢相关信号通路蛋白表达的影响。 结果：在肝细胞中，JAZF1抑制条件下的AKT和AMPK的磷酸化差异不明显，无统计学意义。在脂肪细胞中，AKT/PKA/HSL脂代谢通路和AMPK/TORC2糖代谢通路均被抑制，有显著的统计学差异（P0.01）。 结论：JAZF1基因抑制是糖尿病糖脂代谢中信号通路的重要影响因素，其作用加重了糖尿病的风险。JAZF1基因可能是促进糖脂代谢信号通路发生磷酸化的重要因子。