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精索静脉曲张不育患者精子蛋白组学研究

何犇  
【摘要】:目的:(1)建立和优化精索静脉曲张(varicocele, VC)不育患者精子蛋白质组双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术;(2)利用2-DE对VC不育病人手术前后精子蛋白质进行分离,结合软件对比2-DE图谱,寻找差异蛋白质点;(3)利用获得的肽质量指纹图谱(PMF)检索差异蛋白质点进行数据分析处理,为更进一步深入研究VC导致不育的分子机制打下基础。 方法:(1)提取VC不育患者精子蛋白,以clean-up kit法和丙酮沉淀法预处理蛋白提取物,分别采用不同上样量(200ug、250ug和300ug),不同胶条(pH3-10L、pH3-10NL和pH5-8),不同的水化方式进行双向电泳;(2)提取VC不育患者手术前后精子蛋白,以clean-up kit法预处理蛋白提取物,采用250ug的精子样品上样量,选取pH5-8的固相化pH梯度胶条和主动水化方式进行双向电泳;(3)运用PDQuest8.0双向凝胶图像软件分析比较VC不育患者手术前后的电泳图谱,寻找手术前后的差异蛋白质点;(4)将差异蛋白质点行飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,将得到的肽质量指纹谱(PMF)进行数据库检索和生物信息学分析。 结果:(1)同clean-up kit法进行比较,丙酮沉淀法预处理精子样品导致小分子量蛋白质的损失,且电泳图谱背景较深,影响蛋白分离效果;(2)pH3-10L线性固相化pH梯度胶条中蛋白主要集中在双向凝胶的中间区域,pH3-10NL非线性固相化pH梯度胶条使位于中间部位的蛋白点有所分开,而pH5-8胶条中蛋白点分布最均匀;(3)200ug上样量的图谱背景清晰,但获得的蛋白质点数最少;250ug上样量的双向电泳图谱蛋白点数较多,且图谱分辨率较高;300ug上样量的图谱蛋白点数虽然最多,横向条纹也较多;(4)与主动水化相比,被动水化后图谱的横纵向拖尾明显,背景不均一;(5)运用二维PDQuest双向凝胶分析软件比较发现:VC不育患者手术前组与术后组有20个差异蛋白,后续的质谱成功鉴定15个差异蛋白。 结论:(1)通过比较发现,使用clean-up kit法对样品进行预处理,选取pH5-8的固相化pH梯度胶条,采用精子样品上样量250ug和主动水化方式可以获得背景清晰、分辨率高的图谱;(2)VC不育患者手术前后精子蛋白表达存在差异,这些蛋白质的上调或下调可能与VC患者导致不育有关,对术前与术后的差异蛋白质点的深入研究将对阐明VC导致男性不育的发病机制提供帮助。


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