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颗粒增强免疫比浊法测定血清中同型半胱氨酸的研究

龙腾镶  
【摘要】:近年来,同型半胱氨酸被作为一个独立的危险因子被很多杂志报道。据大量研究得出,心脑血管疾病的发病与同型半胱氨酸密切相关[1][2],高同型半胱氨酸血症也成为临床医学研究的热点,被作为研究心血管疾病发病机制的关键因素。与传统的心脑血管疾病的诊断标志物比较而言不同的是,同型半胱氨酸具有更重要、更特异的临床应用价值。通过流行病学和临床研究证实,与其致病机理有关主要有损伤血管,促进血管平滑肌细胞的增殖。机体中凝血系统与纤溶系统之间平衡被打破,引起脂质代谢紊乱,影响体内的转甲基化反应和致动脉样硬化的细胞分子机制等几个方面也被证实与致病机理有关[3]。 同型半胱氨酸测定方法较多,检测技术更新较快,在早期使用的方法有放免分析法,氨基酸分析仪法,其中放免分析在应用得较广泛,但存在放射性污染问题。气相-质谱法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS法)在那之后也被运用于测定Hcy,现在常用的有荧光偏振免疫分析法(Fluorescence polarizationimmunoassay,FPIA),高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC),循环酶法[4]。HPLC为目前推荐的参考方法[5],但操作繁琐,试验耗时长,且成本太贵,不适宜于临床大批量测定;此外,其处理样本、层析条件、样本测定的控制难得标准化也是此方法的不足之处。为解决临床常规实验室测定同型半胱氨酸所遇到的问题,结合以上各种方法的特点,本研究的目的是建立颗粒增强免疫比浊法试剂盒,并适合于临床常规实验室使用。 目的: 用纯化的S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenonsyl-homocysteine SAH)免疫Balb/c小鼠,制备SAH单克隆抗体;建立同型半胱氨酸的颗粒增强免疫比浊法(Immunoturbidimetric assay),并依据临床及实验室标准协会(Clinical and LaboratoryStandards Institute CLSI)颁布的标准和指南性文件,对建立的方法进行系统性评价实验。 方法: 1.运用经典单抗技术制备SAH的单克隆抗体。利用细胞融合技术,筛选可稳定分泌抗SAH的杂交瘤细胞株,在动物体内诱生腹水方式研究制备SAH的单克隆抗体,并验证单抗效价与特异性。 2.利用饱和硫酸铵法、层析法、PEG浓缩法联合对SAH单克隆抗体进行纯化。 3.表达纯化S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteinehydrolase,SAHase),并对纯化的SAHase进行验证。 4.采用经典的胶乳颗粒包被抗体法,建立同型半胱氨酸测定试剂(颗粒增强免疫比浊法) 5.依据临床及实验室标准协会(CLSI)颁布的标准和指南性文件,对建立颗粒增强免疫比浊法进行性能分析实验。 结果: 1.运用单抗技术获得了的三株杂交瘤细胞(分别命名SAH-M1、SAH-M2、SAH-M3)的培养上清,与SAH、腺苷、蛋氨酸、S-腺苷蛋氨酸等物质进行特异性反应,以上几种干扰物加入包被SAH-BSA的酶标板,进行ELISA测定,结果显示其中SAH-M3可特异性地结合SAH。 2.筛选获得了的杂交瘤细胞,通过Balb/C小鼠制备了小鼠腹水,并按顺序采用沉淀、层析脱盐,浓缩等方式将单抗纯化。以磷酸盐缓冲液稀释蛋白浓度至1.0mg/ml,分装后放置于-80℃贮存。 3.对纯化SAHase酶进行Western Blot验证,Western Blot结果显示含有目的蛋白,与Mark的条带进行对得出表达的酶分子量约为45kD,这与目的蛋白的相对分子量约在40-50KDa符合。 4.采用经典的胶乳颗粒包被抗体法,将SAH包被在150nm胶乳颗粒上作为反应液,建立了测定Hcy的颗粒增强免疫比浊法,经过一系列的方法学评价,得出建立的方法各项性能指标与商品化的试剂一致,与本法与循环酶法、HPLC法相关性均良好,测定样本中血清Hcy浓度无显著性差异,满足临床实验室的需求。 结论: 1.利用经典的单抗技术成功制备获得SAH单克隆抗体。 2.经过一系列的表达纯化工艺,成功制备获得SAHase。 3.采用经典的胶乳颗粒包被抗体法,建立了测定Hcy的颗粒增强免疫比浊法,与商品试剂较好的一致性,与HPLC法及循环酶法相关性良好,操作简便,对仪器要求不高,普通的生化仪即可,符合临床实验室的需求。


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