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乳酸杆菌对变形链球菌体外作用研究

王勤花  
【摘要】:龋病是口腔中的常见疾病,虽然病程发展较为缓慢,但是它发病率高、流行区域广泛,而且破坏的牙体组织不能自行修复,不仅影响口腔健康也可影响身体健康,与癌症、心血管疾病一起被联合国世界卫生组织(WHO)列为三大非传染性疾病。在病因学研究中,发现细菌是影响龋病形成和发展的主要因素。变形链球菌(Streptococcusmutans,Sm,变链菌)是口腔中的常居菌群,也是公认的重要的致龋菌,其主要的毒力因子包括产酸耐酸性,黏附素、葡聚糖的产生等等,变链菌发挥致龋作用的重要前提条件是形成菌斑生物膜结构。 对于龋病的防治来说,控制菌斑是一个关键步骤。研究表明,目前抗菌药物的应用和机械去除法是控制菌斑的主要手段,这两种方法往往结合使用加强效果。尽管如此,这仍然存在一定不足:长期使用抗菌药物控制菌斑,可能产生细菌耐药性,还会引起菌群失调,增加口腔中其它疾病机会性感染的风险;机械去除法虽然快速有效,若操作者没有很强的依从性,就很难长期维持菌斑控制的理想水平。 乳酸杆菌(Lactobacillus,乳杆菌)是广泛应用的益生菌,在调节胃肠道生态平衡方面发挥重要作用,一方面它可以与致病菌在生物膜中竞争结合位点,另一方面其代谢产物里含有的有机酸、细菌素、类细菌素等抑菌成分能够明显抑制病原菌的生长。 有些研究表明乳杆菌可与变链菌共聚,也有部分乳杆菌及代谢产物对变链菌有明显抑制作用,但是大多是局限于浮游状态下的细菌。在菌斑生物膜中,细菌生理状态发生显著变化,与浮游状态相比具有更强的耐药性及毒力,而且抵抗宿主免疫防御能力也明显增强。本项研究的主要内容是检测乳杆菌对不同状态中变链菌的作用影响,若能在调节口腔微生态平衡的基础上探索发现新的龋病防治方法将非常有意义。 目的:变形链球菌是龋病的主要致病菌,乳杆菌既是口腔中的常居菌群也是广泛应用的益生菌。选取嗜酸乳杆菌ATCC4356,体外研究它对浮游状态和生物膜中的变形链球菌UA159作用影响,以期为龋病防治提供些理论依据。 材料和方法:(1)采用共培养的方法,将嗜酸乳杆菌ATCC4356、变形链球菌UA159按一定比例混合悬浮于PBS缓冲液中,室温下震荡15sec后静置20min,检测二者共聚现象。(2)检测细菌浓度、缓冲液pH值、不同糖发酵底物、唾液、钙离子等实验条件对共聚的影响。(3)将嗜酸乳杆菌ATCC4356接种于MRS液体培养基中,获取乳杆菌的无菌发酵上清液并进行浓缩。用琼脂扩散法检测嗜酸乳杆菌ATCC4356代谢产物对变形链球菌UA159的抑制作用。将浓缩上清液60℃水浴20min后检测对变链菌的抑制作用,然后分别用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶处理浓缩上清液,观测对变链菌的抑制效果变化,初步定性抑菌物质的有效成分。以MRS培养基为对照,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析浓缩上清液中可溶性蛋白成分。(4)按照三个实验分组:变形链球菌UA159接种于BHI液体培养基、变链菌UA159与乳杆菌ATCC4356按1/1比例接种于BHI液体培养基、变形链球菌UA159接种于乳杆菌发酵上清液与BHI混合液体培养基,分别形成细菌生物膜,通过硝酸银染色法、扫描电镜检测乳杆菌ATCC4356及代谢产物对变链菌生物膜形成的影响。 结果:(1)嗜酸乳杆菌ATCC4356与变形链球菌UA159有共聚现象产生。(2)不同细菌浓度共聚现象有差异;在pH4.0-pH8.0范围内,以不同糖类为发酵底物,唾液为缓冲液时二者均可共聚;而EDTA洗涤细菌去除钙离子后共聚现象消失,重悬于钙离子溶液中共聚能力恢复。(3)以变形链球菌UA159为指示菌,嗜酸乳杆菌ATCC4356浓缩上清液对变链菌UA159有明显的抑制作用。浓缩上清液水浴加热处理后抑菌效果无明显变化,而胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶处理后抑制作用消失。与MRS培养基浓缩液相比,浓缩上清液中主要差异蛋白条带约位于6.3KD。(4)嗜酸乳杆菌ATCC4356和变形链球菌UA159共培养的生物膜与变形链球菌UA159纯培养的生物膜比较有差异,嗜酸乳杆菌ATCC4356发酵上清液加入BHI培养的变链菌UA159生物膜与变形链球菌UA159纯培养的生物膜比较差异更明显。 结论:(1)嗜酸乳杆菌ATCC4356可与变形链球菌UA159产生共聚。(2)嗜酸乳杆菌ATCC4356可以利用不同糖类为发酵底物,在广泛pH值范围内与变形链球菌UA159共聚,唾液不影响共聚,但此共聚具有钙离子依赖性。(3)排除了有机酸、过氧化氢等物质的影响后,嗜酸乳杆菌ATCC4356代谢产物对变形链球菌UA159有抑制作用,初步定性有效的抑菌物质为蛋白质。依据SDS-PAGE推测起作用的蛋白质可能为分子量为6.3KD的细菌素。(4)嗜酸乳杆菌ATCC4356及代谢产物对变形链球菌UA159生物膜形成有抑制作用。


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