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巯乙磺酸钠对大肠杆菌生物膜的干预作用及机制研究

陈盛  
【摘要】:第一部分巯乙磺酸钠对大肠杆菌生物膜早期黏附及胞外聚合物的影响 【目的】研究巯乙磺酸钠对大肠杆菌生物膜(biofilm,BF)早期黏附及胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)的影响。 【方法】琼脂平板稀释法检测巯乙磺酸钠对大肠杆菌ATCC25922的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);采用了平板菌落计数法检测高浓度、低浓度巯乙磺酸钠(2mg/ml、0.5mg/ml)在不同时间点(2、4、6、8h)对大肠杆菌黏附的影响;采用免疫荧光技术标记多糖和细茵,利用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)定性观察细菌黏附及胞外多糖变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌胞外多糖的产量;利用考马斯亮蓝染料结合法(Bradford法)测定胞外蛋白含量。 【结果】巯乙磺酸钠干预2、4、6、8h后,与生理盐水对照组比较,各组黏附细菌数均有所减少(F值分别为31.038、11.180、80.686、10.362,P 0.05),高浓度组较低浓度组更明显(P 0.05);经巯乙磺酸钠干预8h后,经FITC-ConA和PI双染,激光扫描共聚焦显微镜观察见菌落稀疏,散在分布,胞外多糖减少,稀薄,以高浓度为甚;胞外多糖定量实验中,胞外多糖(μg)/细菌干重(mg)在高浓度组为(13.57±0.59),在低浓度组为(27.77±0.77),分别与生理盐水对照组(35.73±0.44)比较,均降低了胞外多糖的产生(F=3332.150,P0.05),高浓度组较低浓度组更明显(P0.05);胞外蛋白定量实验中,胞外蛋白(μg)/细菌干重(mg)在高浓度组为(7.76±0.32),在低浓度组为(17.59±0.86),分别与生理盐水对照组(23.31±1.36)比较,均降低了胞外蛋白的产生(F=688.129,P 0.05),高浓度组较低浓度组更明显(P0.05)。 【结论】巯乙磺酸钠能显著减少大肠杆菌生物膜的早期黏附,也能减少大肠杆菌生物膜胞外多糖及胞外蛋白的生成。 第二部分巯乙磺酸钠对大肠杆菌生物膜形成的影响以及单独和联合环丙沙星大肠杆菌BF的作用 【目的】研究巯乙磺酸钠对大肠杆菌生物膜(biofilm,BF)形成的影响,以及单独及联合环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)对成熟大肠杆菌BF的作用。 【方法】琼脂平板稀释法检测CIP对大肠杆菌ATCC25922的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);扫描电镜观察巯乙磺酸钠对大肠杆菌BF形成的作用;平板计数法检测巯乙磺酸钠单独及与CIP联用后BF内活菌数;用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanningmicroscopy,CLSM)观察巯乙磺酸钠对成熟的大肠杆菌BF空间结构的影响并结合BF图像结构分析软件(image structure analyer,ISA)定量分析BF结构参数。 【结果】 CIP对大肠杆菌ATCC25922的MIC是0.25μg/ml;巯乙磺酸钠能减少BF中基质样物质以及被膜的厚度;单用巯乙磺酸钠,8mg/ml才能使BF中的活菌数减少(P0.05),单用CIP,1MIC才可使BF中活菌数降低(P0.05),小剂量巯乙磺酸钠(1mg/ml)与1/2MIC的CIP联合应用就可使BF上的活菌数明显减少(P0.05);CLSM图像显示经巯乙磺酸钠作用后的BF厚度逐渐减少,密度逐渐稀疏;ISA软件定量分析显示:5mg/ml巯乙磺酸钠作用后,BF厚度变小(F=67.880,P0.05)、平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)(F=15.977,P0.05)和结构熵(textual entropy,TE)均减少(F=39.432,P0.05),区域孔率(areal porosity,AP)增加(F=25.100,P0.05),2mg/ml巯乙磺酸钠干预后效果不如高浓度明显。 【结论】巯乙磺酸钠能够抑制大肠杆菌BF形成,也能破坏成熟大肠杆菌BF形态结构;巯乙磺酸钠与环丙沙星存在协同作用,增强其抗大肠杆菌生物膜的能力。 第三部分巯乙磺酸钠对留置导尿管大肠杆菌生物膜的体内干预作用 【目的】构建留置导尿管大肠杆菌生物膜(biofilm,BF)体内模型;研究巯乙磺酸钠(Mesna)对留置导尿管大肠杆菌BF的的体内干预作用及对导尿管相关性尿路感染(catheter-associated urinary tract infections,CAUTI)的影响。 【方法】1、构建留置导尿管大肠杆菌BF体内模型,分为模型组及对照组,家兔行导尿术,模型组家兔经导尿管注入大肠杆菌菌液4天,扫描电镜(SEM)及平板计数法检测留置导尿管大肠杆菌BF动物模型构建情况;2、巯乙磺酸钠对导尿管大肠杆菌BF的体内干预作用,建立留置导尿管大肠杆菌BF体内模型后,实验分为对照组、生理盐水(NS)组(NS,5ml,膀胱灌注,2次/日)、Mesna组(mesna,20mg/ml×5ml,膀胱灌注,2次/日)、头孢他啶(CAZ)组(CAZ,50mg/kg,静滴,2次/日)、Mesna+CAZ组(mesna,20mg/ml×5ml,膀胱灌注,2次/日+CAZ50mg/kg,静滴,2次/日),每日取尿袋内尿液行菌落计数,3天后处死家兔,扫描电镜(SEM)观察导尿管表面大肠杆菌BF形态改变,平板菌落计数法检测导尿管表面及膀胱壁黏附细菌数,HE染色观察膀胱组织病理改变,ELISA检测血浆中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。 【结果】1、在建立模型实验中,模型组可见大量细菌在导尿管上呈团状或膜状黏附生长,厚薄不均的黏液状物质连接成一大片,平均菌落计数模型组为(4.78±0.28)(Log10CFU)较对照组(1.05±0.10)(Log10CFU)明显增多(t=17.44,P0.01);2、在干预实验中,Mesna组在第二天能使尿袋中细菌减少;Mesna组较CAZ组更明显地破坏了留置导尿管表面大肠杆菌BF形态及减少了导尿管上细菌数;Mesna组及CAZ组均能使膀胱壁黏附细菌数减少,联合治疗组更明显;对照组及NS组可见膀胱粘膜破损,粘膜细胞充血、水肿,大量炎症细胞侵润;Mesna组及CAZ组黏附完好,细胞充血、水肿减轻,炎症细胞少;联合治疗组黏膜完好,细胞充血、水肿进一步减轻,炎症细胞侵润进一步减少;对照组、NS组、Mesna组、CAZ组及Mesna+CAZ组IL-1β含量分别为397.97±100.75、402.87±109.81、287.35±65.05、257.81±78.36、138.61±55.71(pg/ml)(F=12.650, P0.05), TNF-α的含量分别为525.30±81.09、491.94±138.54、251.12±79.51、254.60±78.36、135.68±46.77(pg/ml)(F=28.207, P0.05)IL-6的含量的分别为840.60±106.92、837.39±120.67、556.17±108.57、446.32±129.33、188.54±43.65(pg/ml)(F=54.184, P0.05),巯乙磺酸钠降低了IL-1β、TNF-α、IL-6水平,联合治疗更明显。 【结论】留置导尿管表面大肠杆菌BF动物模型成功建立;巯乙磺酸钠对体内留置导尿管表面大肠杆菌BF有破坏作用,能降低细菌对膀胱的黏附,并能减轻膀胱病理变化,减轻由IL-1β、TNF-α、IL-6导致的尿路免疫损伤,联合头孢他啶治疗作用更明显。 第四部分巯乙磺酸钠对大肠杆菌黏附蛋白及胞外多糖生成相关基因的作用 【目的】研究不同浓度巯乙磺酸钠对大肠杆菌flu、fimH、papC、glmS、glmU、msbB、 IpxA基因表达的作用,为巯乙磺酸钠抗大肠杆菌生物膜作用提供机制。 【方法】实验分为四组:对照组、巯乙磺酸钠0.5mg/ml组、巯乙磺酸钠2mg/ml组、巯乙磺酸钠5mg/ml组;将过夜培养的大肠杆菌ATCC25922菌液稀释至OD(600)=0.05,分别加入相同体积的LB培养基、0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的巯乙磺酸钠,2h后收集菌液。运用实时定量PCR检测各组基因的相对表达量。 【结果】与对照组相比,巯乙磺酸钠0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml组的flu基因的相对表达量分别为0.587±0.058、0.334±0.054、0.480±0.075,2mg/ml时最低,5mg/ml则较2mg/ml组升高; fimH基因的相对表达量分别为0.601±0.014、0.370±0.064、0.407±0.056在2mg/ml、5mg/ml时降低明显(P 0.05);papC基因的相对表达量分别为0.628±0.06、0.278±0.072、0.30±0.0053,在2mg/ml和5mg/ml组较0.5mg/ml组明显下降(P 0.05);glmS基因的相对表达量分别为0.624±0.105、0.378±0.085、0.469±0.105,在2mg/ml、5mg/ml时最低(P 0.05);glmU基因的相对表达量分别为0.585±0.062、0.285±0.075、0.172±0.007,随浓度升高表达下降,在5mg/ml时下降最明显(P 0.05);msbB基因的相对表达量分别为0.697±0.096、0.52±0.088、0.36±0.045,并随浓度升高表达下降,5mg/ml时下降最明显(P 0.05);lpxA基因的相对表达量分别为0.937±0.146、0.632±0.125、0.761±0.09,在0.5mg/ml组与对照组比较无显著性差异,但在2mg/ml、5mg/ml时均出现下降(P 0.05),2mg/ml组更明显(P 0.05)。 【结论】巯乙磺酸钠抑制了大肠杆菌于黏附有关的flu、fimH、papC基因的表达,也抑制了与多糖生成有关的glmS、 glmU、msbB、 IpxA基因的表达;不同浓度巯乙磺酸钠对其抑制作用不同,并不随浓度增高而增强。


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