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纳米级微泡增强乳腺肿瘤显像效果及高强度聚焦超声消融效果的实验研究

王冬  
【摘要】:分子生物学(molecular biology)及其分支学科分子影像学(molecular imaging)技术发展迅速,并扩展到超声分子成像(ultrasound molecular imaging)领域。 分子影像技术的关键在于分子探针(molecular probe)的选择,超声造影剂(Ultrasound contrast agent,UCA)作为新型的超声分子影像探针,是目前研究的热点,UCA是一种稳定的含气泡的物质,临床常用于发现微小病变以及区分良、恶性肿瘤等方面,其原理是改变声速(sonic speed)、声衰减系数(attenuationcoefficient)、增强后散射(backscattering)等,利用组织与气泡之间产生的声阻抗(acoustic impedance)差,增加组织与血流之间的回声信号,提高组织血流灌注的超声显像分辨率,从而提高超声诊断的特异性、灵敏度。 传统的的UCA属血池显像剂(blood pool imaging agent),一定程度上影响了超声分子成像及治疗的发展,近年纳米级造影剂(nanoscale contrast agent)不断涌现,纳米级UCA具有很强的穿透力,能穿过血管壁,直达靶区细胞,其开发和应用有利于发展靶向性、高效性、小型化且具有辅助治疗作用的新型UCA。 超声造影(contrast enhanced ultrasound,CEUS)技术为乳腺癌等的诊断、鉴别等提供了有力的帮助,研究表明,常用的CEUS属于非特异性显影,UCA对组织没有特异性结合力,仅能观察感兴趣区血管短暂显影(动脉相),不能在特定组织内长时间驻留,影响了诊断率;近年特异性CEUS成为研究的热点,其核心内容是在微泡表面连接特异性抗体,利用其与靶区相应受体特异性结合的特点,使微泡选择性浓聚于靶区而产生特异性增强显影,导向分子和UCA的小型化是该技术的关键;近来兴起的纳米抗体(nanobody)及小分子抗体模拟肽(peptide mimics),具有与抗原特异性结合的特性,可以克服传统单克隆抗体分子量过大、穿透力较弱等缺点,易于大量生产;靶向性的纳米级UCA聚集于特定区域时产生显影,未聚集则不产生显影,有利于提高诊断的准确性。 高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound,HIFU)在治疗恶性肿瘤方面取得了很大进展,临床HIFU术中,存在辐照剂量较大、辐照时间较长等问题,易引起并发症,学者们提出改变组织结构、密度、血供、功能等组织声环境(AET),以加速声能沉积,提高HIFU疗效,减少并发症;UCA可以提高HIFU疗效,其机理可能是:①增强空化声孔(sonoporation)效应,②升高靶区温度,③影响细胞增殖,④毛细血管破坏;常用的UCA粒径较大,不能透过血管内皮间隙直达肿瘤细胞,并且,声通道组织中的微泡过大过多,可导致聚焦超声不能聚焦或焦点偏移等问题,纳米级微泡(nanobubble,NB)有望弥补常规微泡的弱点,实现肿瘤的血管外显影和治疗。 我们在成功研制微米级微泡的基础上,优化制备工艺研制NB,对分析其基本性质,在兔VX2乳腺肿瘤模型上,研究其增强实质显像的效果,以及作为增效剂在增强HIFU消融效果中的作用。 另一方面,常规超声技术对HIFU实时疗效评价主要依赖于灰阶(grey scale)值变化,这种方法存在灵敏度较差、依赖操作医生主观判断等问题,灰阶值变化不明显时,易发生误判,导致辐照剂量增大、治疗时间增多,引起不必要的并发症,目前急需寻找一种更为敏感、准确、可靠的评价方法;以前,超声散斑(speckle)被认为是一种干扰信号而在超声成像时被计算机自动过滤清除,近来,人们开始认识到散斑也是一种信息载体,从而促进了散斑计量术的诞生,有研究表明,声像图散斑图像的相关函数(correlation)、基于小波变换(wavelet transform)的Tamura斑纹分析(texture analysis)、多分辨分析(multi-resolutionanalysis)等可用于判断HIFU辐照的靶区是否发生凝固性坏死(Coagulative Necrosis,CN),并优于灰阶值评价,有望成为新的HIFU实时疗效评价方式。 综上,本课题研究主要包括以下四个部分: 目的:在成功研制微米级微泡的基础上,优化制备工艺研制NB,对其基本性质进行初步的研究,以便于下一步应用。方法:应用优化的工艺制备纳米微泡,二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)等及辅助成分,按比例混合(脂质微泡获国家专利,可广泛应用于动物实验中,增强肝脏,心脏、肾脏等脏器的成像),超纯水将上述成分充分混悬均匀,经一定工艺制成混悬液,分装于锥形瓶中,使用优化的工艺冻干混悬液,以提高脂质膜的密封性,加入水合液(自制)重新水合,注入八氟丙烷(C3F8)气体,水平往复式机械振荡,频率≧4500次/分,振幅:(15士1) mm,振荡约90s左右,低速离心法对已制备的原始微泡分级分离,300RPM离心3分钟后,微泡悬浮液分为上下两部分,上层粒度较大的微泡被丢弃,留取下层粒度较小的微泡进行下一步实验。生理盐水稀释50倍后,进行肉眼观察、光镜观察、电镜观察、荧光显微镜观察,Zeta Sizier3000测定微泡的粒径、表面电位。结果:自制的微泡,肉眼观察呈白色凝乳状,封装于西林瓶中,振荡前为清亮的半透明液体,振荡后呈白色凝乳状的混悬液,表面未见泡沫,黏稠,不透明;光镜下观察,微泡呈类圆形,数量较多,分布均,无聚集,偶见较大的脂质体小颗粒;电镜下,微泡粒径不足1μm;粒径测试结果均值623.4nm,分布于278.8nm~697.0nm之间,表面电位均值1.3mV,分 布于-3.2mV~+9.5mV之间。结论:各种成膜材料中,脂质(lipids)的弹性较好、对温度要求不高、毒副作用少、无免疫原性,在本实验中,我们以脂质为成膜成分,在人体安全剂量条件下,改进各类脂质及辅助成分配方比例,加入C3F8(惰性气体,可安全地经肺排除);考虑到机械振荡法较常用的声振法产生的热量小、对脂质体等成分活性破坏少、产泡量高、污染小等特点,我们采用合适的振荡频率和时间机械振荡制备微泡;采用优化后的冻干工艺(合适的预冻温度、冻干时间、冻干速度、真空压力等)及灭菌方式,最后与低速离心法相结合,得到NB,肉眼及镜下观察微泡呈类圆形,数量较多,分布较均匀,无聚集,稳定性较好,理论上可以通过肿瘤组织的血管内皮间隙。 目的:在制备NB的基础上,选择小分子多肽AHNP(序列为:FCDGFYACYMDV,荧光标记)与NB结合,研究其体外寻靶作用,在兔VX2乳腺肿瘤模型上,研究NB增强实质显像效果。方法:①活性剂与NB混匀,加入激活剂碳化二亚胺(EDC)与AHNP混合,室温反应30min,机械振荡后静置片刻,去下清液,缓冲液(PBS)冲洗,得到靶向NB。花环形成实验、花环形成阻断实验、免疫荧光染色观察靶向NB体外寻靶效果。②健康纯种新西兰白兔(famale)30只,麻醉后将提前制备好的VX2肿瘤组织悬液注入双侧乳腺组织各1ml,两周后经logiq9彩色多普勒超声诊断仪检查,选取乳 腺区肿瘤组织直径大小约15mm左右的兔24只进行实验,实验兔麻醉后,随机分组为靶向NB组10只,声诺维(Sonovue)组10只,PBS组4只,耳缘静脉分别注射靶向NB、Sonovue、PBS,Logiq9超声诊断仪记录并观察体内增强显像效果。结果:标记荧光的携AHNP的NB,呈浅黄色,光镜下,微泡均匀细密分布,检测微泡的粒径与非靶向微泡相比稍大,荧光显微镜下观察,靶向NB见绿色荧光,非靶向微泡偶见零星的微弱荧光,花环形成率达80%以上,特异性结合靶向微泡的细胞阳性率约60%;实验兔超声显示乳腺肿瘤边界清楚,截面呈椭圆形,内部低回声,彩色多普勒显示肿瘤内部血供丰富,频谱多普勒显示为动脉频谱,实验兔注射靶向NB后,平均8s(5s~12s)出现血管增强显像,注射后平均15s(9s~20s),实质回声增强,增强效果最长持续时间15min左右,Sonovue组注射后平均11s(7s~19s)出现增强显像,最长持续时间20min左右,PBS组无增强效应。结论:AHNP为抗p185her2/neu的特异性单克隆抗体CDR-H3环的模拟多肽,与HER2具有抗体样的特异性结合能力,AHNP与NB结合,有较强的体外寻靶效果,在兔VX2乳腺肿瘤模型中,靶向NB能达到增强肿瘤实质显像的效果,实验中及实验后,各组实验兔均无不良反应,亦证实了自制NB的安全性。 目的:在HIFU消融兔VX2乳腺肿瘤的过程中,联合使用自制的NB,观察其在不同辐照声功率、不同辐照时间条件下,对HIFU消融的增效作用,探讨NB在超声治疗中的应用价值。方法:携VX2乳腺肿瘤兔52只,随机分组为HIFU+NB组26只,HIFU+PBS组26只,脱毛,0.15mg/Kg剂量的“速眠新”麻醉,经耳缘静脉通道推注2.5%戊巴比妥钠(25mg/kg)持续麻醉,固定,启动聚焦超声肿瘤治疗系统,定位,辐照前10s,经耳缘静脉通道注射PBS(0.2ml/kg)或NB(0.2ml/kg),继而生理盐水1ml推注,调整焦点使其位于肿瘤内部,调整辐照声功率(150W,120W,100W)及时间(3s,5s)行HIFU辐照,系统自动分析辐照前后靶区超声灰阶变化值。HIFU辐照后1天,做病理检查,统计数据并分析。结果:HIFU治疗前超声显示肿瘤边界清楚,截面呈椭圆形,内部低回声,彩色多普勒显示肿瘤内部血供丰富,频谱多普勒显示为动脉频谱,HIFU治疗后靶区血供基本消失,偶见靶区周边点状血供;HIFU治疗前肿瘤造影显示为增强显像,HIFU治疗后肿瘤造影显示为靶区无明显增强显像,靶区周边增强显像,形成所谓“负显影”效果;HIFU治疗中及治疗后,实验兔无明显不良反应,1例实验兔HIFU+NB治疗两周后,乳腺肿块完全消失(考虑是否与HIFU治疗后促进了肿瘤细胞凋亡等有关);HIFU辐照后靶区灰度出现增强,5s时间条件下,不同辐照声功率(120W、150W),HIFU+NB组靶区辐照后平均灰阶变化明显高于HIFU+PBS组,统计学分析有明显差异(P0.01),但在100W、5s条件下,HIFU+NB组靶区辐照后平均灰阶差变化与HIFU+PBS组相比较,无明显差别,HIFU+NB组内分析,发现在150W和120W条件下,5s辐照组的平均灰阶差均明显高于 3s辐照组(P0.05);150W、5s同等条件下HIFU辐照后,肉眼观察辐照区呈灰白色灶,坏死灶分界清,HIFU+NB组坏死范围明显大于HIFU+PBS组;HE染色结果显示,HIFU+NB组与HIFU+PBS组的靶区组织内均见明确的凝固性坏死,HIFU+NB组发生凝固性坏死范围明显大于HIFU+PBS组(P0.001),HIFU+NB组内对比分析,在同等辐照时间下,150W辐照声功率较120W辐照声功率损伤范围增加,在同等辐照声功率下,5s辐照时间较3s辐照时间损伤范围增加,120W、5s辐照条件与150W、3s辐照条件造成的的损伤效果基本一致。结论:在HIFU消融过程中,NB可以利用“负显影”效果,判断HIFU有效治疗区域;在同等辐照声功率、辐照时间条件下,HIFU+NB组较HIFU+PBS组,能有效提高辐照后灰阶变化,明显增大辐照后凝固性坏死的范围,提示NB能减少辐照强度,缩短辐照时间,达到增强HIFU损伤效果的目的。NB可同时应用诊断和治疗领域,其具体作用机制(如空化效应、声孔效应)以及辐照后远期致细胞凋亡效应等还有待进一步深入研究。 目的:采用纹理分析、相关函数评价HIFU+NB增强乳腺肿瘤消融的效果,寻求比灰度变化更有效的实时判断HIFU疗效的方法。方法:携VX2乳腺肿瘤兔60只,随机分组为HIFU+NB组30只,HIFU+PBS组30只,麻醉固定后,JC-200聚焦超声肿瘤治疗系统消融,辐照前10s,经耳缘静脉通道注射PBS(0.2ml/kg)或NB(0.2ml/kg),继而生理盐水1ml推注,采集辐照前后图像;病理检查;Matlab截取感兴趣去(ROI),进行两次小波变换,提取纹理分析1和2等参数;Matla软件截取辐照前后靶区声像图,像素大小30*30,计算辐照后即刻与辐照前靶区声像图的相关函数最大值;分析得出的结果录入WEKA3.7,采用支撑适量机(SVM)建立决策平面,分析样本;统计数据。结果:HIFU+PBS组,纹理分析1和2判断CN特异度与敏感度与灰阶判断有统计学差异,各组P<0.05。HIFU+NB组,纹理分析1和2判断CN特异度与敏感度与灰阶判断有统计学差异,各组P<0.05。HIFU+NB组与HIFU+PBS组辐照前后声像图应用相关函数对CN的判断灵敏度高于灰阶判断(P0.05)。应用相关函数总判对率高于灰阶(P0.05)。结论:初步证实纹理分析与灰阶评价相比,在判断CN的灵敏度及特异度上,更有优越性。而相同辐照条件下,相关函数分析对CN的总判对率高于灰阶。


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